Titelaufnahme

Titel
Interaction of urokinase receptor and integrins on endothelial cells and its implication in VEGF-induced migration / submitted by Revu Ann Alexander
VerfasserAlexander, Revu Ann
Begutachter / BegutachterinFreissmuth, Michael
Erschienen2012
Umfang92 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2012
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Urokinase-Rezeptor / Angiogenese / VEGF
Schlagwörter (EN)urokinase receptor / angiogenesis / VEGF
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-8409 Persistent Identifier (URN)
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Interaction of urokinase receptor and integrins on endothelial cells and its implication in VEGF-induced migration [5.13 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Vascular endothelial growth factor (VEGF) ist ein sehr potenter Wachstumsfaktor, der sowohl die physiologische als auch die pathologische Angiogenese steuert. VEGF initiiert Angiogenese, indem er die Migration von Endothelzellen stimuliert. Die stimulierten Endothelzellen dringen in das umgebende Gewebe ein. Dies erfordert, dass der proteolytische Abbau der extrazellulären Matrix durch das Plasminogen-System mit der gerichteten Zell-Migration durch Integrin-Matrix-Interaktionen koordiniert wird. Der Urokinase-Rezeptor (uPAR), der an der zelloberfläche exprimiert wird, ist eine zentrale Komponente des Plasminogen-Systems. Der Komplex aus aktiver Urokinase/Plasminogen-Aktivator (uPA) und dem Urokinase-Rezeptor (uPAR) beschleunigt die Umwandlung von Plasminogen zu Plasmin, damit wird eine proteolytische Kaskade aktiviert, die zum Abbau der extrazellulären Matrix führt. Frühere Versuche wiesen nach, dass eine Stimulation mit VEGF bei Endothelzellen nicht nur zur Aktivierung der pro-Urokinase (pro-uPA) und damit zu einem Abbau der extrazellulären Matrix führt sondern auch zu einer koordinierten Internalisierung des Urokinase-Rezeptors in einem Komplex mit einem Mitglied der LDLR-Familie führt. Dies wird durch die Umverteilung des Protease-Rezeptor uPAR an fokalen Adhäsionen ausgelöst. Die Bedeutung der Internalisierung ist offensichtlich: Wenn die Internalisierung von uPAR verhindert wird, wird die endotheliale Zellmigration unterdrückt und damit in vivo die Angiogenese gehemmt. Da uPAR keine direkten Liganden in der nativen Basalmembran hat, muss seine regulierte Internalisierung durch Assoziation mit einem anderen Zelloberflächenmolkül zustande kommen. Die Arbeitshypothese der vorliegenden Dissertation ging dacon aus, dass uPAR mit einem Integrin interagiert, weil Integrin-Matrix-Interaktionen eine wichtige Rolle bei der Zellwanderung spielen. Diese Hypothese wurde in verschiedenenAnsätzen geprüft: (i) Mittels Durchflusszytometrie wurde die Internalisierung von uPAR und [beta]1-Integrinen in VEGF-stimulierten Endothelzellen quantifiziert. (ii) Mit konfokaler Mikroskopie wurde die VEGF-induzierte Cointernalisierung von uPAR und [alpha]5[beta]1-Integrin in Endosomen visualisiert. (iii) Diese Internalisierung war abhängig von uPAR und von Rezeptoren aus der Low Density Lipoprotein (LDL)-Rezeptor-Familie. Die VEGF-induzierte Integrin-Umverteilung war in Abwesenheit von uPAR herabgesetzt; sie wurde auch durch inhibitorische Peptide, die die uPAR / Integrin-Interaktion blockieren, gehemmt. Wenn uPAR-defiziente Endothelzellen bzw. Endothelzellen, die mit inhibitorischen Peptiden inkubiert waren, mit VEGF stimuliert wurden, war die die Migration der Endothelzellen herabgesetzt. (iv) Die VEGF-induzierte Interaktion zwischen uPAR und [alpha]5[beta]1-Integrin wurde an lebenden Endothelzellen mit einem neuartigen Ansatz der Mikrostrukturierung visualisiert: Mit immobilisierten gegen [alpha]5[beta]1-Integrin gerichteten Antikörpern wurden die Integrine auf der endothelialen Zelloberfläch in ein Muster gezwungen. Nach Inkubation der Endothelzellen mit VEGF verteile sich uPAR in dasselbe Muster. Diese Beobachtung beweist, dass die beiden Proteine in lebenden Endothelzellen in Abhängigkeit von VEGF miteinander interagieren. Die Ergebnisse der Experimente liefern daher eine Bestätigung für die Arbeitshypothese.

Darüber hinaus legen die Beobachtungen nahe, dass uPAR ein wesentlicher Bestandteil des Netzwerks an Signalproteinen, über die VEGF die Endothelzellmigration kontrolliert: uPAR ist ein Flaschenhals, durch den die VEGF-induzierte Signale geschleust werden müssen, um sowohl die proteolytische Aktivität an der invadierenden Membran zu fokussieren als um die Umverteilung und Rezirkulation der Integrine zu steuern.

Zusammenfassung (Englisch)

Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a very potent growth factor that drives both, physiological and pathological angiogenesis. VEGF initiates angiogenesis by activating endothelial cells to migrate and invade surrounding tissues. This requires the coordinated proteolytic degradation of the extracellular matrix by the plasminogen system and regulation of cell-migration provided by integrin-matrix interaction. The cell surface-bound urokinase receptor (uPAR) is a central component of the plasminogen system. The active urokinase:urokinase receptor complex accelerates the conversion of plasminogen to plasmin, initiating a proteolytic cascade leading to extracellular matrix degradation. Previous experiments showed that VEGF-stimulation of endothelial cells induced pro urokinase (pro-uPA) activation; this was accompanied not only by extracellular matrix degradation but also by coordinated internalization of the urokinase receptor complexed to a member of the LDLR family. Internalization is preceded by redistribution of the protease receptor uPAR to focal adhesions. Preventing the internalization of uPAR blocks endothelial cell migration and in vivo angiogenesis. uPAR does not have any primary ligand in the native basement membrane. Hence, internalization is likely to be contingent on the formation of uPAR with another partner. Because of the central role of integrins in matrix interactions, the working hypothesis underlying this thesis posits that uPAR forms a complex and is internalized with integrins. This conjecture was verified by using several approaches: (i) flow cytometry-based internalization experiments allowed for quantifying the VEGF-induced internalization of uPAR in endothelial cells. (ii) Confocal microscopy visualized the co-internalization of uPAR and [alpha]5[beta]1 integrins upon angiogenic stimulation of endothelial cells with VEGF. (iii) This retrieval was contingent on uPAR and on receptors of the low density lipoprotein (LDL) receptor family. VEGF-induced integrin redistribution was inhibited by elimination of uPAR from the endothelial cell surface or by inhibitory peptides that block the uPAR/integrin interaction. The absence of uPAR or the presence of the inhibitory peptides also imparied the migratory response of endothelial cells to VEGF. (iv) VEGF-promoted complex formation between uPAR and [alpha]5[beta]1 integrin was also visualized on live endothelial cells by using a micropatterning approach:

immobilized [alpha]5[beta]1 integrin antibody imposed a pattern on the surface-expressed [alpha]5[beta]1 integrins. In response to VEGF uPAR was driven into the complex and thus adopted the pattern as dictated by the [alpha]5[beta]1 integrin antibody. This observation provided direct and incontrovertible evidence that the two proteins interacted in live VEGF-stimulated endothelial cells. Taken together the observations confirmed the working hypothesis. The findings indicate that uPAR is an essential component of the network through which VEGF controls endothelial cell migration: uPAR is a bottleneck through which the VEGF-induced signal must be funnelled for both, focused proteolytic activity at the leading edge and for redistribution and recycling of integrins.