Titelaufnahme

Titel
Generation of modified vaccinia virus ankara recombinants by rescue of the essential D4R gene / Patricia Sonja Ricci
VerfasserRicci, Patricia Sonja
Begutachter / BegutachterinWöhrer, Wilfried
Erschienen2011
Umfang117 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2011
Anmerkung
Zsfassung in dt. und span. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)MVA / Vakzinia / Rescue Technik
Schlagwörter (EN)MVA / Vaccinia / Rescue / host range selection
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-8322 Persistent Identifier (URN)
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Generation of modified vaccinia virus ankara recombinants by rescue of the essential D4R gene [2.2 mb]
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Zusammenfassung (Englisch)

Modified vaccinia virus Ankara (MVA) is an attenuated vaccinia virus that belongs to the genus Orthopoxviridae. MVA is growth incompetent in humans, has a well established safety record and elicits a broad immune response.

In this study, a new technique for the generation of MVA recombinants on the basis of vaccinia virus D4R rescue is presented. The rescue procedure is based on a growth defective MVA, that lacks an essential gene, and reintroduction of this gene for selection. The D4R gene is essential for MVA and deletion of this sequence leads to defective viruses that can only replicate in an engineered cell line that complements the deleted D4R gene product. In parental D4R-defective viruses, foreign genes can be introduced together with the essential D4R gene that restores the growth competent phenotype (rescue). In the resulting recombinants, the foreign genes are integrated into the D4R / D5R intergenic region, while the wild type MVA backbone is not modified by integration of additional marker cassettes. To grow defective parental virus, a D4R complementing cell line was generated by retroviral transduction of wild type avian DF-1 cells. In this cell line D4R-defective MVA was created by homologous recombination. Application of this defective MVA as the parental virus for generation of MVA recombinants was examined with the example of a yellow fever (YF) virus surface antigen. The resulting recombinants were fully growth competent and could be isolated in wild type, non-complementing cells where parental defective virus growth is inhibited. By applying this rescue technique, 100% of the recombinants showed adequate structure, purity and foreign gene expression after only one plaque purification round.

Thus, the MVA D4R rescue technique established in this study is a useful tool for rapid and stringent selection of recombinant MVA. Parental D4R defective viruses are permanently inhibited in wild type cells allowing rapid and efficient selection of recombinant replicating virus. For experimental purposes, MVA stocks that efficiently express foreign genes can thus also be generated without any plaque purification solely by passage following recombination.

Rescue of the original D4R gene enables the integration of target genes into the viral genome without further selection markers. Absence of marker sequences is a requirement for state of the art vaccine vectors.

Zusammenfassung (Deutsch)

Das modifizierte Vakzinia Virus Ankara (MVA) ist ein stark attenuiertes Vakzinia Virus aus dem Genus der Orthopoxviren. MVA ist in menschlichen Zellen vermehrungsunfähig, hat ein gut etabliertes Sicherheitsprofil und erzeugt eine breite Immunantwort, was es zu einem guten Impfstoffvektor macht.

In dieser Studie wird eine neue Technik zur Herstellung von MVA Rekombinanten auf Basis der Vakzinia Virus D4R Rescue Technik präsentiert. Die Rescue Technik basiert auf einem vermehrungsunfähigen MVA dem ein essenzielles Gen fehlt und Wiedereinführung dieses Gens für die Selektion von Rekombinanten. Das D4R Gen ist ein essenzielles Gen dessen Deletion defekte, replikationsunfähige Viren erzeugt, die sich nur noch in D4R komplementierenden Zellen vermehren können. Mit der Rescue Prozedur können neben der Wiederaufnahme des essenziellen D4R Gens auch fremde Gene co-integriert werden. Die Wildtyp Grundstruktur des Virus bleibt hierbei unverändert.

Um D4R defekte Parentalviren zu isolieren wurde zuerst eine D4R komplementierende Zelllinie generiert. Das D4R Gen wurde hierzu durch retrovirale Transduktion stabil in das zelluläre Genom integriert wodurch die Zellen fortan das essenzielle virale Genprodukt exprimieren.

Anschließend wurde durch homologe Rekombination in diesen Zellen das D4R-defiziente MVA Parentalvirus generiert. Die Anwendung dieses defekten Virus zur Herstellung von Rekombinanten mittels der Rescue Technik wurde mit einem Gelbfiebervirus Oberflächenantigen beispielhaft untersucht. Diese Rekombinanten konnten in nicht komplementierenden Wildtyp Zellen isoliert werden, in welchen das Parentalvirus vermehrungsunfähig ist. Nach nur einer Plaquereinigungsrunde zeigten bereits 100% der Isolate die erwünschte genomische Struktur, Reinheit und Expression des Fremdgens. Zu experimentellen Zwecken können mit dieser Technik daher auch ohne Plaquereinigung nur durch Passagierung zeitsparend rekombinante Viren isoliert werden, die das Fremdgen exprimieren.

Die Integration des Wildtyp D4R Gens in D4R defekte Parentalviren erlaubt somit die Einführung von Fremdgenen in die Wildtyp Virusstruktur, ohne Einsatz von zusätzlichen, unerwünschten Markergenen.