Titelaufnahme

Titel
Amphetamine action at dopamine and serotonin transporters is modulated by aCaMKII / submitted by Thomas Steinkellner
VerfasserSteinkellner, Thomas
Begutachter / BegutachterinSitte, Harald
Erschienen2013
Umfanggetr. Zählg. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2013
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Dopamintransporter / Serotonintransporter / Amphetamine / Kokain / Sucht und Abhängigkeit / Mausmodelle
Schlagwörter (EN)dopamine transporter / serotonin transporter / amphetamine / cocaine / drug addiction / mouse models
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-8174 Persistent Identifier (URN)
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Amphetamine action at dopamine and serotonin transporters is modulated by aCaMKII [7.4 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Die Neurotransmitter Dopamin und Serotonin werden durch membranständige Transporter, den Dopamintransporter (DAT) bzw. den Serotonintransporter (SERT), aus dem synaptischen Spalt entfernt und in das präsynaptische Neuron zurückgepumpt. Dieser thermodynamisch ungünstige Prozess ist möglich, da die Transporter den elektrochemischen Natriumgradienten nutzen und den Transport der Neurotransmitter mit der Aufnahme von Natrium koppeln. Abgesehen von ihrer Rolle bei der Neurotransmitterwiederaufnahme sind der DAT und der SERT auch von entscheidendem pharmakologischem Interesse, da sie die molekularen Hauptangriffspunkte von Psychostimulantien (Amphetamin, Kokain) und Antidepressiva sind. Antidepressiva (z.B. Fluoxetin, Citalopram) und Kokain inhibieren diese Transporter kompetitiv und verhindern dadurch die Wiederaufnahme von Dopamin und Serotonin. Im Unterschied dazu sind Amphetamine (z.B. ,Speed' ,Ecstasy') Substrate an beiden Transportern, die nicht nur mit der Wiederaufnahme der endogenen Neurotransmitter Dopamin und Serotonin konkurrieren, sondern den eigentlichen Transportvorgang umkehren und einen sogennanten "reversen Transport" induzieren. Der Mechanismus dieses reversen Transports hängt einerseits von Ionengradienten ab, wird aber auch von intrazellulären Proteinkinasen beeinflusst. Es wurde gezeigt, dass die Serin-/Threoninkinase Ca2+/Calmodulin-abhängige Proteinkinase II a (aCaMKII) direkt an den Carboxylterminus des DAT bindet und Serine am Aminoterminus phosphoryliert. Pharmakologische Hemmung der aCaMKII führt zu einer signifikanten Reduktion in der Amphetamin-induzierten DAT-vermittelten Substratfreisetzung in Zellen und in striatalen Hirnschnitten aus der Ratte. Im Rahmen meiner Dissertation habe ich versucht herauszufinden, ob die Interaktion zwischen der aCaMKII und dem DAT auch physiologisch relevant ist. Dabei habe ich auf verschiedene Mausmodelle zurückgegriffen und gefunden, dass eine genetische Deletion der aCaMKII bzw. eine genetisch-induzierte Mutation an einer für die aCaMKII entscheidenden Aminosäure den Amphetamin-induzierten reversen Transport signifikant reduzieren. Zusätzlich habe ich ein Mausmodell des Angelman Syndroms (AS) untersucht. AS Patienten leiden an einer Reihe von motorischen Defiziten und weisen autistische Züge auf. Diese Symptome legen eine Störung des dopaminergen und serotonergen Systems nahe. Weiters haben AS Mäuse eine permanent inhibierte Form der aCaMKII.

Im Einklang mit den bisherigen Befunden, habe ich in den AS-Mäusen eine Reduktion in der Amphetamin-induzierten DAT-vermittelten Freisetzung gefunden. Dieser Befund deutet auf ein dysfunktionales Dopaminsystem in AS Patienten hin. Um herauszufinden, ob die Interaktion zwischen dem DAT und der aCaMKII auch in vivo eine Rolle spielt, habe ich eine Reihe von verhaltenspharmakologischen Experimenten durchgeführt und gefunden, dass die lokomotorische Induktion durch Amphetamin in Mäusen ohne aCaMKII geringer ist als in Kontrolltieren. Zusätzlich habe ich gefunden, dass Mäuse ohne aCaMKII erhöhte extrazelluläre Dopaminlevel haben, die vermutlich durch eine Steigerung in der vesikulären Dopaminfreisetzung begründet sind. Nachdem der SERT eine hohe Homologie mit dem DAT aufweist, habe ich auch untersucht, ob der SERT durch die aCaMKII beeinflusst wird. Experimente in Zellen und ex vivo Hirnpräparationen aus der Maus zeigten, dass der reverse Transport auch am SERT abhängig von der aCaMKII ist. Biochemische Experimente legen außerdem nahe, dass der SERT direkt mit der aCaMKII interagiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Amphetamin-induzierte reverse Transport sowohl am DAT als auch am SERT von der aCaMKII moduliert wird und dass eine Störung dieser Interaktion möglicherweise in Zusammenhang mit den motorischen und autistischen Symptomen von AS Patienten steht.

Zusammenfassung (Englisch)

The cocaine- and antidepressant-sensitive dopamine and serotonin (5HT) transporters (DAT and SERT) mediate the reuptake of the neurotransmitters dopamine and 5HT from the synaptic cleft, respectively. They hence regulate the dopamine and 5HT content available for synaptic transmission. Certain stimuli, such as changes in the ionic composition of the extracellular fluid or psychostimulants (e.g.

amphetamines) are able to induce outward transport via both, DAT and SERT and thus increase extracellular dopamine and 5HT concentrations.

Influx and efflux of substrates via these transporters are thought to be asymmetrical processes that are not only regulated by ion gradients but also modulated by intracellular kinases. It has been demonstrated that removal of N-terminal serines ablates amphetamine-induced reverse transport of DAT. Similarly, truncation of the SERT-N terminus abolished amphetamine-induced SERT-mediated 5HT efflux. Hence, the N-terminus of DAT and SERT seem to be important for amphetamine action. Interestingly, the Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II a (aCaMKII) has been demonstrated to bind to the DAT C-terminus and to phosphorylate N-terminal serines. Pharmacological inhibition of aCaMKII dramatically reduced amphetamine-induced efflux both, in cells stably transfected with the human DAT as well as in rat striatal slices. Based on these findings, I wanted to investigate the role of aCaMKII on the modulation of amphetamine-induced DAT-mediated reverse transport in mice deficient of functional aCaMKII by using a combination of in vitro, ex vivo and in vivo experiments. Besides, I wanted to find out, whether SERT was also regulated by aCaMKII and whether they interacted biochemically.

Additionally, the phosphoinositide PIP2 was investigated for its role in reverse transport at SERT. My thesis shows that aCaMKII regulates amphetamine-induced DAT-mediated efflux in mice with different mutations in the aCaMKII gene. Mice lacking aCaMKII (aCaMKII-KO) or mice with a permanently self-inhibited version of aCaMKII (aCaMKII T305D) display significantly reduced amphetamine-induced substrate efflux. A similar finding was observed in a mouse model of Angelman Syndrome, a neurogenetic disease characterized by motor impairments and autism spectrum disorders. Angelman Syndrome mice have a reduced aCaMKII activity and show comparable impairments in DAT function as aCaMKII mutants. This suggests that DAT-mediated dopaminergic signalling is affected in Angelman Syndrome. In vivo experiments revealed that aCaMKII-deficient mice have elevated extracellular dopamine levels but still display a decreased amphetamine-induced dopamine efflux. The increased dopamine levels of aCaMKII-KO mice are not caused by a decrease in DAT-mediated dopamine reuptake but are most likely due to an increase in vesicular dopamine release. Behaviourally, the increased dopaminergic tone of aCaMKII-KO mice translates into a profound hyperactivity and severe deficits in acute and chronic locomotor responses to both, amphetamine and cocaine. I further show that aCaMKII regulates the closely-related SERT: both pharmacological inhibition and genetic disruption of aCaMKII function significantly attenuate amphetamine-induced SERT-mediated substrate efflux in transiently transfected cells and mouse brain preparations. Similarly, depletion of PIP2 impairs reverse transport at SERT in both, cells and rat slices. In conclusion, aCaMKII exerts an important modulatory role in amphetamine-induced DAT- and SERT-mediated subtstrate efflux. The finding that DAT-mediated efflux is affected in Angelman Syndrome mice might help in the understanding of the underlying pathophysiology.