Titelaufnahme

Titel
Development of viral carrier-based allergy vaccines / author: Katarzyna Niespodziana
Verfasser / VerfasserinNiespodziana, Katarzyna
Begutachter / BegutachterinValenta, Rudolf
Erschienen2011
Umfang225 S. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2011
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Allergie / rekombinantes Allergen / Immunotherapie / Rhinovirus / Vakzine / Kapsidproteine / Peptide
Schlagwörter (EN)Allergy / recombinant allergen / Immunotherapy / Rhinovirus / Vaccine / Capsid proteins / peptides
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-8759 Persistent Identifier (URN)
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Zusammenfassung (Deutsch)

Mehr als 25% der Menschen leiden an IgE-vermittelten Allergien. Während Pharmakotherapie die Symptome der Allergie lindern kann, ist Allergen-spezifische Immuntherapie (SIT) die einzige die Krankheit modifizierende und Antigen-spezifische Behandlung. Ein wesentlicher Nachteil der SIT, der ihre breite Anwendung verhindert, ist jedoch die Anwendung von Allergen-Extrakten. Diese enthalten die natürlichen Allergen-Moleküle, die häufig zu IgE-und T-Zellen-vermittelten Nebenwirkungen führen. Aus diesem Grund wurden mehrere neue Strategien entwickelt, um die Allergenität von therapeutischen Präparaten zu verringern, unter Wahrung ihrer immunologischen Eigenschaften.

Der Schwerpunkt dieser Dissertation liegt in der Erarbeitung, Expression und Reinigung einer neuartigen Form von Allergie-Impfstoffen bezogen auf rekombinante Fusionsproteine, die aus viralen Carrier-Proteinen (d.h. Rhinovirus-abgeleitetes VP1 und Hepatitis B Virus-abgeleitetes PreS.) und nicht-allergenen Peptiden abgeleitet von der Oberfläche der wichtigsten Allergene (d.h. Lieschgras: Phl p 1; Katzenschuppen: Fel d 1), bestehen. Die rekombinanten Fusionsproteine wurden in Escherichia coli exprimiert und gereinigt. Ihr Mangel an IgE-Reaktivität wurde mittels ELISA bewiesen und ihre reduzierte allergieauslösende Aktivität wurde durch Aktivierung der Basophilen in in vitro Tests nachgewiesen. Nach der Immunisierung von Kaninchen und Mäusen mit den Fusionsproteinen, wurden allergen-spezifische IgG-Antikörper induziert, die die Bindung von IgE allergischer Patienten an das Allergen hemmen und nicht gegen den Wildtyp des Allergens sensibilisieren. Aufgrund der Reduktion allergen-spezifischer T-Zellen-Epitope und durch das Fehlen von IgE-Reaktivität, wird von diesen Träger-basierten Impfstoffen erwartet, dass sie keine IgE- und T-Zellen-vermittelte Nebenwirkungen haben werden. Sollte ihre Wirksamkeit in klinischen Studien bewiesen werden, kann es möglich sein, bequeme, sichere und breit anwendbare Formen der SIT als echte Alternativen zur symptomatischen, medikamentösen Behandlung von Allergien zu entwickeln (Kapitel III-VI).

Im Zuge der Arbeiten hat sich gezeigt, dass die VP1-basierten Impfstoffe VP1-spezifische Antikörper erzeugten, die eine Rhinovirus Infektion menschlicher HeLa-Zellen gehemmt haben. Daher wurden rekombinante VP1 Proteine weiter genutzt, um zu untersuchen, ob sie in der Lage sind, anti-viralen Schutz in Form von Antikörper-Antworten in Mäuse und Kaninchen zu induzieren. Zu diesem Zweck wurden VP1 Proteine aus zwei sehr entfernt verwandt HRV-Stämme, HRV89 und HRV14, in Escherichia coli exprimiert und gereinigt. Antikörper, die durch Immunisierung mit diesen Antigenen induziert wurden, wiesen starke kreuz-neutralisierende Aktivität für verschiedene HRV-Stämme auf. Ein HRV Impfstoff, der einen derart breiten Schutz bietet, kann besonders nützlich sein für die Impfung von Patienten mit Rhinovirus-induzierten Erkrankungen der Atemwege und sollte somit Asthma-Exazerbationen reduzieren (Kapitel VII).

Weiters wurde die humorale Antwort auf die HRV Kapsidproteine und Epitope untersucht. Die Bestimmung von IgG1-4, IgA und IgM -Antikörper-Spiegeln auf gereinigte rekombinante Rhinovirus Kapsidproteine, VP1-VP4, und rekombinante und synthetische VP1 Fragmente ergab, dass sich die humorale Antwort in der Unterklasse IgG1 und IgA-Klasse befunden hat und vor allem gegen ein hochkonserviertes N-terminales VP1 Peptid gerichtet war (Kapitel VIII). Molecular Modelling mit Hilfe der drei-dimensionalen HRV Kapsidstrukturen hat gezeigt, dass sich dieses Peptid im Innen des Kapsids befindet und keine Sequenzen für Rezeptorbindung oder HRV Neutralisation enthält (Kapitel VIII). Eine genaue Charakterisierung der humoralen Immunantwort gegen Rhinoviren wurde auch in einem Mausmodell durchgeführt. Diese Ergebnisse haben bewiesen, dass kreuz-serotypische Immunantworten in Mäusen induziert werden können und dass der anti-virale Schutz wiederholte Infektionen erfordert. Weiters hat sich gezeigt, dass das dominante Ziel der Antikörper-Reaktion in den infizierten Mäusen das Kapsidprotein VP1 ist (Kapitel IX).

Schließlich wurden die rekombinanten HRV Kapsidproteine, VP1 und VP4, auf Membran-destabilisierenden Wirkungen mit Viren und dem Virus-abgeleiteten Peptid mit einem neuartigen elektrophoretischen Verfahren auf Basis eines Chips untersucht. Es zeigte sich, dass Viren und rekombinantes VP1 viel effektiver zur Störung von Liposomen geignet waren als das von der N-terminalen Sequenz des VP1 abgeleitetes amphipathische Peptid (Kapitel X).

Zusammenfassung (Englisch)

More than 25% of the population suffer from IgE-mediated allergies. While pharmacotherapy can mitigate the symptoms of allergy, allergen-specific immunotherapy (SIT) is the only disease-modifying and antigen-specific treatment. However, a major disadvantage of SIT which prevents its broad application is the use of allergen extracts containing natural allergen molecules that frequently results in IgE- and T cell-mediated side effects. For this reason, several new strategies are being developed to reduce the allergenicity of therapeutic preparations, while maintaining their immunological features.

The main aim of the current thesis was to construct, express and purify a novel type of allergy vaccines based on recombinant fusion proteins consisting of viral carrier proteins (i.e. rhinovirus-derived VP1 and hepatitis B virus-derived PreS) and non-allergenic peptides derived from the surface of major allergens (i.e., timothy grass: Phl p 1; cat dander: Fel d 1). The recombinant fusion proteins were expressed in Escherichia coli and purified. Their lack of IgE reactivity was demonstrated by ELISA and their reduced allergenic activity was proven by in vitro basophil activation tests. Upon immunization of rabbits and mice, the fusion proteins were able to induce allergen-specific IgG antibodies which inhibited the binding of allergic patients IgE to the allergen. Due to the reduction of allergen-derived T cell epitopes and the lack of IgE reactivity, these carrier-based allergy vaccines are expected to eliminate IgE- as well as T cell-mediated side effects. Should they prove effective in clinical trials, it may become possible to develop convenient, safe and broadly applicable forms of SIT as true alternatives to symptomatic, drug-based allergy treatment (Chapter III-VI).

In the course of the work, it has been found that the VP1-based vaccine gave rise to VP1-specific antibodies which inhibited rhinovirus infections of human HeLa cells. Therefore, recombinant VP1 proteins were further utilized to study whether they are able to induce cross-protective antibody responses in mice and rabbits. For this purpose, VP1 proteins from two distantly related HRV strains, HRV89 and HRV14, were expressed in Escherichia coli and purified. Antibodies induced by immunization with these antigens exhibited strong cross-neutralizing activity for different HRV strains. Such a broadly cross-protective HRV vaccine may be especially useful for the vaccination of patients suffering from rhinovirus-induced respiratory diseases and may thus reduce asthma exacerbations (Chapter VII).

Another part of the thesis was focused on the investigation of humoral responses against rhinovirus coat proteins and epitopes thereof. Determination of IgG1-4, IgA and IgM antibody levels to the purified recombinant capsid proteins, VP1-VP4, as well as recombinant and synthetic VP1 fragments revealed that the memory immune response resided in the IgG1 subclass and IgA class and was mainly directed against a highly conserved N-terminal VP1 peptide. Molecular modelling using the three-dimensional HRV capsid structures showed that this peptide is located inside the capsid and does not include sequences involved in receptor binding or HRV neutralization (Chapter VIII). A detailed characterization of humoral immune responses to human rhinovirus has also been performed in a mouse model of infection. These results have proven that cross-serotype immune responses are generated in mice following rhinovirus infection and that mucosal and protective responses require repeated infections. Furthermore, it has been shown that the dominant target of the antibody responses in infected mice is the rhinovirus-derived capsid protein VP1 (Chapter IX).

Finally, recombinant HRV capsid proteins, VP1 and VP4, were used to investigate membrane-destabilizing effects of rhinovirus and of a virus-derived peptide by a novel chip electrophoretic method. Remarkably, virus and recombinant VP1 were much more effective in promoting liposome leakage than the amphipathic peptide derived from N-terminal sequence of the VP1 (Chapter X).