Titelaufnahme

Titel
Single nucleotide polymorphisms associated with antibiotic resistance in clinically relevant pathogens / submitted by Verena Pecavar
VerfasserPecavar, Verena
Begutachter / BegutachterinWalochnik, Julia
Erschienen2013
Umfang113 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2013
Anmerkung
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Clostridium difficile / Rifaximin / Single nucleotide polymorphisms / High resolution melting analysis / Antibiotika Resistenz / Punkt Mutationen
Schlagwörter (EN)Clostridium difficile / Rifaximin / Single nucleotide polymorphisms / High resolution melting analysis / Antibiotic resistance / Point mutations
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-8831 Persistent Identifier (URN)
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Single nucleotide polymorphisms associated with antibiotic resistance in clinically relevant pathogens [10.26 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Der weltweite Anstieg von Antibiotika resistenten Bakterien ist ein großes Problem für das öffentliche Gesundheitssystem. Die Resistenztestung humanpathogener Bakterien erfordert eine schnelle und gezielte Charakterisierung für eine optimale Behandlung des Patienten. Clostridium difficile ist weltweit der häufigste Erreger nosocomial erworbener Diarrhoe. Ein vielversprechendes Antibiotikum, vor allem zur Behandlung rezidiver C. difficile Infektionen (CDI) ist Rifaximin. Rifaximin Resistenz in C. difficile wird durch Punkt Mutationen (SNP) im rpoB Gen (kodiert die ß- Untereinheit der RNA Polymerase) und daraus resultierenden Aminosäuren Substitutionen verursacht. Das Ziel dieser Dissertation war die Etablierung einer schnellen, stabilen und kosteneffektiven Methode zum Nachweis von SNPs im rpoB Gen klinischer C. difficile Isolate. Es wurde ein Detektionssystem bestehend aus einer PCR und einer High-resolution melting curve Analyse (HRM) deren Zielsequenz die hot-spot Region des rpoB ist, etabliert. Durch die Sequenzierung eines 325 bp großen DNA Fragments des rpoB Gens von 348 C. difficile Stämmen und konnten 24 Punktmutationen detektiert werden. Somit konnten 16 PCR Sequenz-Typen (PCR-ST) definiert werden. Aufgrund der Größenlimitierung des DNA Fragments in der HRM (152 bp) wurden 15 von 24 SNPs detektiert und infolgedessen 11 HRM Kurven Profile (HRM-CP) definiert. Mit dieser HRM können bis auf Ausnahme von zwei SNPs alle zuvor publizierten Punktmutationen die mit Rifaximin Resistenz assoziiert werden, nachgewiesen werden. Die zweite Studie behandelt die Eignung von Rifaximin für die Durchführung eines Disk-diffusion Test im Vergleich mit einem Broth Mikrodiulution Assay. Die Studie zeigte äquivalente Ergebnisse im Vergleich der beiden Testmethoden. 62 C. difficile Stämme wurden als Rifaximin resistent getestet und die Sequenzierung des rpoB (325 bp) zeigte Punktmutationen in allen untersuchten Stämmen. Das dritte Projekt beschreibt die Etablierung einer real time PCR zur raschen Detektion von SNPs im 16S rRNA Gen, die mit Amikacin, Kanamycin und Capreomycin Resistenzen in extensive drug resistant Mycobacterium tuberculosis assoziiert werden. Zusammenfassend zeigt diese Dissertation, dass PCR basierende Methoden schnelle, stabile und kosteneffektive Nachweismethoden zur Bestimmung von Resistenzen in humanpathogenen Bakterien sind und somit Einfluss auf die Behandlung betroffener Patienten hat.

Zusammenfassung (Englisch)

Antibiotic resistance in clinically relevant pathogens is a major public health problem worldwide. Since the numbers of antibiotic resistant bacteria are increasing a fast clarification of the resistance is essential for the treatment of affected patients.

Clostridium difficile is the main causative of hospital-acquired diarrhoea worldwide and rifaximin is an antibiotic for the treatment of C. difficile infections (CDI) especially in case of recurring CDI. Reduced rifaximin susceptibility bases on single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the rpoB gene which encodes the b-subunit of the RNA polymerase, the main target of rifaximin. The aim of this thesis was the establishment of a new detection method of SNPs in rpoB of clinical C. difficile isolates. In the main study, the screening of 348 C. difficile samples of different PCR ribotypes by conventional PCR (325 bp amplicon) revealed 16 PCR-sequence types (PCR-ST) characterised by 24 detected SNPs. High-resolution melting curve (HRM) analysis established 11 different HRM-curve profiles (HRM-CP) based on 15 of 24 SNPs located in the rpoB hot-spot region (151 bp amplicon). Beside two SNPs associated with reduced rifaximin susceptibility, all previously published SNPs are detectable by this HRM. In another project on the suitability of rifaximin for disc diffusion test in comparison to rifaximin broth microdilution assay 62 phenotypically reduced rifaximin susceptible C. difficile strains were identified. Sequence analysis of the 325 bp rpoB amplicon revealed the presence of non-synonymous SNPs in these strains corroborating the association of SNPs in rpoB with reduced rifaximin susceptibility.

Moreover, this study showed that the rifaximin disc diffusion test is equivalent to the rifaximin broth microdilution assay. The third project was dedicated to a RT-PCR for the rapid determination of antibiotic resistance (amikacin, kanamycin and capreomycin) based on SNPs in the 16S rRNA gene in extensive drug resistant Mycobacterium tuberculosis strains. Altogether, this thesis demonstrates that PCR based methods, especially HRM are fast, reliable and cost-effective techniques to determine antibiotic resistance in clinically relevant pathogens. Moreover, fast antibiotic susceptibility testing methods in routine laboratories may have an impact on the treatment of infected patients.