Titelaufnahme

Titel
A novel multiplex protein biochip for a newly identified diagnostic Alzheimers disease-specific platelet biomarker panel / submitted by Michael Veitinger
VerfasserVeitinger, Michael
Begutachter / BegutachterinZellner, Maria
Erschienen2014
Umfang145 Bl. : Ill., graph. Darst.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2014
Anmerkung
Zsfassung in dt. Spache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Alzheimer Krankheit / Biomarker / Protein Expression / Algorithmus / Blutplättchen / Proteomics / Multiplex Protein Biochip / Apolipoprotein E4 / APOE4 / Polymorphismus
Schlagwörter (EN)Alzheimer's disease / biomarker / protein expression / algorithm / platelets / proteomics / multiplex protein biochip / apolipoprotein E4 / APOE4 / single nucleotide polymorphism
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-8827 Persistent Identifier (URN)
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A novel multiplex protein biochip for a newly identified diagnostic Alzheimers disease-specific platelet biomarker panel [13.56 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Der starke Anstieg der Praevalenz verheerender Alterserkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit (AK) steht in engem Zusammenhang mit der stetig steigenden Lebenserwartung. Trotz massiver Forschungsanstrengungen und der Entdeckung von extraneuronalen senilen amyloiden Plaques und intraneuronalen fibrillaeren Buendeln vor bereits einem Jahrhundert ist ihre Aetiologie noch immer nicht vollstaendig geklaert. Die Erforschung dieser beiden histologischen Charakteristika und deren molekularer Pathways lieferte neue Erkenntnisse ueber die AK, trotzdem gibt es noch immer keine Heilung und eine zuverlaessige ante mortem Diagnose ist ebenfalls stark limitiert. Neurophysiologische Untersuchungen und Neuroimaging liefern nach wie vor die zuverlaessigste Diagnose, sind jedoch impraktikabel fuer Routineuntersuchungen. Kritisch fuer klinische Diagnostik ist der beschraenkte Zugang zu geeignetem Probenmaterial da Hirnbiopsien kaum zugaenglich und invasive Methoden zur Gewinnung von Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit noetig sind. Genanalysen identifizierten einige hoch praediktive Single-Nukleotid-Polymorphismen welche darueber hinaus spezifisch fuer die fruehe familiaere AK oder die spaetmanifeste sporadische AK sind. Vermutlich sind bis zu zwei Drittel des AK-Risikos genetisch bestimmt, den verbleibenden Rest tragen vor allem Umweltfaktoren bei. Da sich beides im Proteom wiederspiegelt, untersuchten wir mittels zweidimensionaler differentieller Gelelektrophorese Blutplaettchen auf AK-spezifische Veraenderungen der Proteinexpression. Blutplaettchen sind leicht zugaenglich, einfach zu reinigen, DNA-frei und zudem ein anerkanntes Modell fuer Neuronen da sie beispielsweise Neurotransmitter und Schluesselproteine des amyloiden Pathways exprimieren. In diesem Zusammenhang ermittelten wir auch die Stabilitaet der Proteinexpression in gesunden Aelteren um einer Selektion von falschen Biomarkern vorzubeugen und um geeigente Normalisierungs-Proteine mit einer niedrigen biologischen Variation zu bestimmen. Die AK-Biomarker Studie war in zwei Phasen angelegt, um Kandidaten in unabhaengigen Probensets zu iIdentifizieren und zu verifizieren. Von den zehn urspruenglich gefundenen Markern konnten sechs nicht bestaetigt werden und wurden daher von weiteren Untersuchungen ausgeschlossen. Das Summieren der vier verifizierten Biomarker in einem Algorithmus lieferte eine ueberragende Sensitivitaet und Spezifitaet fuer AK. Waehrend diese Forschungsmethode zu zeit- und arbeitsintensiv ist um in der klinischen Routine angewendet zu werden, haben Microarrays grosses Potential in Forschung und Diagnostik gezeigt. Infolgedessen haben wir einen Multiplex Protein Array entwickelt, der die parallele Detektion von hoch und niedrig variablen plasmatischen und zellulaeren Proteinen erlaubt. Nach der Herstellung von hochspezifischen Antikoerpern, der Etablierung individueller Assays und deren Kombination zu einem Multiplex Array wurden klinische Proben durch Proteinquantifizierung und gleichzeitiger (proteomischer) Genotypisierung mit paralleler Normalisierung phaenotypisiert. Die Forschungsergebnisse konnten dabei mit hoher Genauigkeit validiert werden.

Zusammenfassend traegt diese Arbeit dazu bei, die zuverlaessige Erkennung einer der weitverbreitetsten Krankheiten unserer Zeit zu ermoeglichen. Die Analyse klinischer Proben und die Biomarker-Validierung mit dem innovativen Multiplex Array demonstrieren die Staerke solcher Hochdurchsatz-Instrumente und zeigen die erfolgreiche Translation von Forschungsbeobachtungen in klinisch anwendbare Assays. Dieser blutbasierte Protein Biochip bietet die Chance fuer ein einfaches und kosteneffizientes Screening einer grossen Anzahl potentieller AK Patienten innerhalb kuerzester Zeit.

Zusammenfassung (Englisch)

The sharp rise in the prevalence of devastating age-related disorders like Alzheimers disease (AD) is strongly related to the ever-increasing life expectancy. Despite huge research efforts and the detection of extraneuronal senile amyloid plaques and intraneuronal fibrillary tangles already a century ago, its aetiology remains ill-defined. Studying these two histological characteristics and the underlying molecular pathways shed more light on AD, nevertheless, there is still no cure and also solid ante mortem diagnosis is severely limited. Neuropsychological assessment and neuroimaging provide the most reliable diagnosis, though they are impracticable for routine examinations. Critical for clinical diagnostics is the restricted access to appropriate sample material since brain biopsies are hardly obtainable and invasive methods are required to draw brain-surrounding cerebrospinal fluid. Genetic screens have identified several highly predictive single nucleotide polymorphisms which are, moreover, specific for either familial early-onset AD or sporadic late-onset AD. Up to two thirds of AD risk is expected to be genetically determined, primarily environmental factors contribute the remaining percentage. Consequently, since both are reflected in the proteome, we applied two-dimensional differential gel electrophoresis to analyse platelets for AD-specific protein expression alterations. Platelets are readily accessible, easy to purify, free of DNA, and, importantly, an accepted model for neurons as they express e.g. neurotransmitters and key proteins of the amyloidogenic pathway. In this context, the stability of protein expression in healthy elderly was also evaluated to preclude the selection of incorrect biomarkers and to discover normalisation proteins with a low biological variation. The AD biomarker characterisation study was designed in two phases to discover and verify candidates in independent sample sets. From the initially identified ten markers, six failed verification and were excluded from further assessment. Summating the four confirmed biomarkers in an algorithm yielded a superior sensitivity and specificity for AD. Albeit this exploratory technique is too time- and labour- intensive for clinical routine, microarrays have demonstrated enormous potential in research and diagnostics. Thus, we engineered a multiplex protein array capable of parallel detection of highly and lowly variable plasmatic and cellular proteins. After generation of highly specific antibodies, setup of individual assays, and their combination to a multiplex array, clinical samples were phenotyped by protein quantification along with (proteomic) genotyping and parallel normalisation. With high accuracy, the exploratory findings were validated.

In summary, this work contributes to enable reliable detection of one of the most widespread diseases nowadays. Analysis of clinical samples and biomarker validation with the innovative multiplex array evidence the power of this high-throughput device and demonstrate the successful translation of research observations into clinically applicable assays. This blood-based protein biochip offers the great opportunity for easy and cost-effective screening of a huge number of suspected AD patients in a minimum of time.