Titelaufnahme

Titel
Release of nucleotides from neuroendocrine cells and oligomerization of receptors and enzymes for nucleosides and nucleotides
VerfasserHussl, Simon
Betreuer / BetreuerinBöhm, Stefan
Erschienen2016
UmfangX, 94 Blatt
Datum der AbgabeAugust 2016
SpracheEnglisch
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Nukleotide / Rezeptor / Freisetzung / Oligomerisierung
Schlagwörter (EN)nucleotide / receptor / release / oligomerization
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-9062 Persistent Identifier (URN)
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Zusammenfassung (Deutsch)

Viele Zellen setzen Nucleotide in den Extrazellularraum frei, welche dort mannigfaltige Funktionen via ionotroper P2X und metabotroper P1 und P2Y Rezeptoren ausüben. NTPDasen hydrolysieren ATP zu Nukleosiden und sind oft mit Purinrezeptoren kolokalisiert. Zuerst widmeten wir uns der Frage, ob die Freisetzung von ATP aus neuroendokrinen PC12 Zellen ausschließlich von Vesikelexozytose abhängt, oder ob auch nicht vesikuläre Komponenten beteiligt sind. Wir kreierten PC12 Zellen, die stabil die leichte Kette von Botulinum Toxin C1 exprimierten. Dieses bewirkt durch die Spaltung von Syntaxin 1A eine verringerte Vesikelexozytose. Die Expression wurde durch eine reduzierte Syntaxin 1A Expression in Zellmembranen von PC12 Zellen bestätigt. Die transfizierten Zellen zeigten eine deutlich reduzierte spontane und durch Depolarisation ausgelöste Freisetzung von [3H]Noradrenalin. Wir untersuchten die autokrine/parakrine Aktivierung von P2Y12 Rezeptoren als Biosensor für die Nukleotidfreisetzung aus PC12 Zellen. ADP reduzierte die Synthese von cAMP vergleichbar in transfizierten und untransfizierten Zellen. Die Steigerung der cAMP Synthese durch den Abbau von extrazellulären Nukleotiden mittels Apyrase sowie durch P2Y12-Rezeptor Antagonisten war ebenso vergleichbar. Die Hemmung der cAMP Synthese durch depolarisationinduzierte Freisetzung endogener Nukleotide jedoch war deutlich reduziert in Zellen mit eingeschränkter Vesikelexozytose. Demnach hängt in PC12 Zellen die depolarisationsinduzierte Nukleotidfreisetzung im wesentlichen von Vesikelexozytose ab, während die spontane Nukleotidfreisetzung auch nicht exozytotische Komponenten enthält. Weiters beschäftigten wir uns mit der Frage, ob Rezeptoren für Nukleoside und Nukleotide mit NTPDasen, sowie mit anderen Rezeptor Subtypen interagieren. Wir konstruierten Plasmide fluoreszierender Fusionsproteine von A1, A2A, P2Y1, P2Y2, P2Y12, P2Y13 und P2X2 Rezeptoren sowie von NTPDase1 und -2. In HEK293 Zellen wurden die Fusionsproteine an die Zellmembran transportiert und zeigten vergleichbare Funktionalität wie die nicht fluoreszierenden Konstrukte. FRET Microskopie ergab, dass A1, A2A, P2Y1, P2Y12, P2Y13 und P2X2-Rezeptoren Homooligomere bilden. Weiters interagierten alle getesteten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren miteinander sowie mit NTPDase1, nicht jedoch mit ionotropen P2X-Rezeptoren und NTPDase2. Purinerge Signalübertragung wird demnach durch die Freisetzung von Nukleosiden und Nukleotiden, durch deren enzymatische Hydrolyse sowie durch die direkte Interaktion ihrer Rezeptoren und abbauenden Enzyme in Zellmembranen reguliert.

Zusammenfassung (Englisch)

Extracellular nucleosides and nucleotides released from various types of cells exert a plethora of functions via ionotropic P2X and metabotropic P1 and P2Y receptors. NTPDases are hydrolysing nucleoside triphosphates towards nucleosides in the extracellular space. First we addressed the question, if the release of ATP from neuroendocrine PC12 cells exclusively depends on vesicle exocytosis or if it also includes non vesicular factors. Therefore we created PC12 cells stably expressing botulinum toxin C1 light chain, which lead to a decreased vesicle exocytosis via cleavage of syntaxin 1A. Reduced expression was detected by immunoblotting of PC12 membranes. Transfected cells showed significantly reduced spontaneous and depolarization-evoked release of [3H]noradrenaline compared to untransfected cells. We examined the autocrine/paracrine activation of P2Y12 receptors as a biosensor for nucleotide release from PC12 cells. ADP reduced cAMP synthesis to the same extent in transfected and non-transfected cells. Additionally, the enhancement of cAMP synthesis via degradation of extracellular nucleotides by apyrase and via P2Y12 receptor antagonists was not different in wild-type and transfected cells. In contrast, the inhibition of cAMP synthesis by depolarization-evoked release of endogenous nucleotides was significantly reduced in cells with impaired vesicle exocytosis. This indicates that in neuroendocrine cells, depolarization-evoked nucleotide release depends essentially on vesicle exocytosis, whereas spontaneous nucleotide release can arise non-exocytotically. The second part of the thesis copes with the question, if P1 and P2 receptors are able to physically interact with NTPDases as well as with other receptor subtypes. We constructed plasmids coding for A1, A2A, P2Y1, P2Y2, P2Y12, P2Y13, P2X2 receptors as well as for NTPDase1 and -2 fused to fluorescent proteins. The constructs were expressed in HEK293 cells, where they were targeted to membranes and showed comparable functionality as their unlabeled counterparts. FRET microscopy revealed that A1, A2A, P2X2 P2Y1, P2Y12 and P2Y13 receptors form homooligomers and all tested GPCRs show heterooligomerization with each other and with NTPDase1, but not with ionotropic P2X receptors and NTPDase2. Co-immunoprecipitation and FRET competition verified the specificity of the interactions. The results indicate that G protein-coupled purine receptors are able to interact variably with each other and with NTPDase1. Purinergic signaling is therefore regulated by the release of nucleotides, their enzymatic hydrolysis and the direct interaction of their receptors and enzymes expressed within the same membrane compartments.