Titelaufnahme

Titel
Effects of L-type Cav1.4 channels on retinal morphology and potential effect on pineal gland / submitted by Mag.Biol. Dagmar Knoflach
Verfasser / VerfasserinKnoflach, Dagmar
GutachterKoschak, Alexandra
ErschienenWien, 30.08.2016
UmfangXI, 153 Seiten : Illustrationen
HochschulschriftMedizinische Universität Wien, Dissertation, 2016
Anmerkung
Zusammenfassung in deutscher Sprache
Ca v tiefgestellt
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Calciumkanal Cav1.4 / Retina / Morpholgie / Zirbeldrüse / zirkadianer Rhythmus
Schlagwörter (EN)Calciumkanal Cav1.4 / retina / morphology / pineal gland / circadian rhythm
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-9499 Persistent Identifier (URN)
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Effects of L-type Cav1.4 channels on retinal morphology and potential effect on pineal gland [13.35 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Der Calciumkanal Cav1.4 hat die höchste Expression an den Synapsen von Photorezeptoren und spielt eine zentrale Rolle in der Neurotransmitterfreisetzung. Mutationen in dem kodierenden Gen CACNA1f verursacht die Krankheit inkompletter kongenitaler stationärer Nachtblindheit (CSNB2) und wird anhand eines irregulären Elektroretinograms identifiziert. In einem heterologen Expressionssystem zeigt die gain-of-function Mutation Cav1.4I745T (IT) einen ausgeprägten Linksshift in Aktivierung, was auf eine eingeschränkte Funktionsbreite der Photorezeptoren hinweist sowie ein erhöhtes Calciumlevel an den Synapsen. Anhand des Mausmodells Cav1.4-IT wurden funktionelle und morphologische Untersuchungen vorgenommen. Netzhäute wurden mit Ganzfeldlichtimpulsen stimuliert und die Ganglion-zellantwort mittels Multi-Elektrode-Array aufgezeichnet. IT Mäuse zeigten eine präservierte aber verzögerte ON Antwort im Vergleich zu Wildtypmäusen. Die OFF Antwort war stark eingeschränkt. Die Kontrastsensitivität war kompromittiert und die Kontraststeigerung ging verloren. Immunhistologische Untersuchungen zeigten eine reduzierte Netzhautdicke und eine kompromittierte Photorezeptormorphologie. Deren Axone bildeten Knötchen und Verlängerungen sowie vergrößerte, unreife synaptische Ende. Die Dendriten von Horizontal- und Bipolarzellen waren verlängert und wuchsen in die äußere Körnerschicht. Innerhalb der äußeren plexiformen Schicht war das Signal für Gap Junctions sowie des metabotropen Glutamat Rezeptoren 6 reduziert. Die innere Retina war nur geringfügig betroffen. Die intrazelluläre Ca2+ Homeostase innerhalb der Photorezeptoren war betroffen, welches durch eine Färbung gegen Plasmamembran-ATPase gezeigt wurde.

Die Mutation Cav1.4R1816X verursacht einen verkürzten Calciumkanal und weist in einem heterologen Expressionssystem keine calciumabhängige Inaktivierung auf. In dem gleichen System konnte die Wildtypfunktion der Mutation mittels Coexpression eines Polypeptides wieder hergestellt werden. Daher bildet diese Mutation die Grundlage für ein neues Mausmodell um die Auswirkungen verkürzter Calciumkanäle auf Netzhautmorphologie- und funktionalität sowie potentielle Gentherapien zu untersuchen.

Expression von Cav1.4 wurde auch in der Zirbeldrüse gefunden, welches das ausführende Drüse des Tag-Nacht Rhythmus ist. Zirbeldrüse und Netzhaut weisen ein ähnliches Expressionsprofil von L-type Calciumkanäle auf, wie mittels Taqman qRT-PCR gezeigt.

Die Tag-Nacht-Aktivität von IT Mäusen war unter konstanter Dunkelheit verkürzt ist. Auch die Expression von 14 clock genes wurde untersucht. Der untersuchte Zeitpunkt zeigt zwischen IT und Wildtypmäusen keine Unterschiede in Expression auf.

Zusammenfassend ist der Calciumkanal Cav1.4 wichtig für die Signaltransduction innerhalb der Retina, der Reifung von Photorezeptorsynapsen aber auch für die Regulierung des Tag-Nacht-Rhythmus. Allerdings die grundlegenden molekularen Mechanismen müssen noch grundlegender untersucht werden.

Zusammenfassung (Englisch)

The L-type calcium channel Cav1.4 is most abundantly expressed at photoreceptor synapses were it controls neurotransmitter release. Mutations in the encoding gene CACNA1f are linked to congenital stationary night blindness type 2 (CSNB2), and lead to an abnormal electroretinogram.

In a heterologous expression system the gain-of-function mutation Cav1.4I745T (IT) shows a marked leftward shift in activation indicating a reduction in dynamic range of photoreceptors and an increased basal calcium level in photoreceptor synapses. A mouse model carrying the IT mutations allowed investigation of functional and morphological consequences in retina. Whole-mount IT retinas were visual stimulated by full-field flashes and analysed by multi-electrode array recordings. Compared to inbreed controls IT mice showed delayed ON response with reduced firing rate, while the OFF response was nearly abolished. The contrast sensitivity was impaired and contrast enhancement was lost. Immunohistological investigations revealed a significant reduction in total retinal thickness. The photoreceptors were shortened and their axons showed knot-like structures and collaterals. Pedicles were enlarged and immature in their structure. They moved towards the outer nuclear layer, which is in line with severely elongated dendrites of horizontal and bipolar cells. Within the outer plexiform layer the expression of Connexin 36 and metabotropic glutamate receptor 6 signals on the tips of ON bipolar cells was reduced, while the inner retina was only marginal affected by the IT mutation. Staining for the plasma membrane Ca2+ ATPase showed upregulation in the outer retina, hinting towards a disturbance in the intracellular calcium homeostasis of the photoreceptors.

The stop mutation Cav1.4R1816X causes a C-terminal truncation of Cav1.4. The resulting channels lack calcium dependent inactivation in a heterologous expression system, which could be restored by co-transfecting a polypeptide containing the last 122 amino acids. This mutation will form the basis for a transgenic mouse model. With this model the consequences of truncated Cav1.4 channels on retinal morphology and functionality, as well as potential concepts of gene therapy will be investigated.

Beside retina, Cav1.4 is also expressed in pineal gland, the executing gland of the circadian rhythm. Using Taqman qRT-PCR assay I could demonstrate a similar expression profile as in the retina and a downregulation of Cav1.4 in IT mice. The circadian locomotor activity of IT was observed and showed a shortened circadian period (tau) under constant darkness conditions. The expression of 14 key clock genes was analysed for one time point and didnt reveal any difference between IT and inbreed controls.

Taken together Cav1.4 channels do not only play an important role in signal transmission at the photoreceptor synapses but are also involved in the control of the circadian activity. However, the underlying molecular mechanisms have to be further investigated.