Titelaufnahme

Titel
Kinetic analysis of ligand recognition and substrate transport by the human serotonin transporter / submitted by Dr. med. univ. Peter Hasenhütl
Verfasser / VerfasserinHasenhütl, Peter
GutachterFreissmuth, Michael
ErschienenWien, 2016
UmfangVIII, 83 Blätter : Illustrationen
HochschulschriftMedizinische Universität Wien, Dissertation, 2017
Anmerkung
Zusammenfassung in deutscher Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Kinetik / Monoamin Transporter / Serotonin
Schlagwörter (EN)kinetics / monoamine transporter / serotonin
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-9536 Persistent Identifier (URN)
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Kinetic analysis of ligand recognition and substrate transport by the human serotonin transporter [10.09 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Die Monoamine Dopamin, Noradrenalin und Serotonin sind wichtige Neuromodulatoren im menschlichen Gehirn. Nachdem sie durch das präsynaptische Neuron freigesetzt worden sind, werden sie wieder durch spezielle Transportproteine (Dopamin-Transporter, DAT; Noradrenalin-Transporter, NAT; Serotonin-Transporter, SERT) in das präsynaptische Neuron aufgenommen. Pharmakologische Manipulation dieser Transporter hat psychotrope Effekte, was sowohl von schädlicher als auch von therapeutischer Wirkung sein kann.

In dieser Dissertation beschreibe ich elektrophysiologische Experimente, in denen die Bindungskinetik von Kokain, Desipramin und Methylphenidat am Serotonin-Transporter gemessen wurde. Diese wurde mit jener am Dopamin-Transporter verglichen. Es zeigte sich, dass die Selektivität von SERT für Desipramin, sowie die Selektivität von DAT für Methylphenidat, nicht durch die Dissoziationsrate bestimmt wird. Es ist die Assoziation des Inhibitors in die Bindungsstelle, welche die Unterschiede in der Affinität bestimmen. Daraus kann geschlossen werden, dass die strukturellen Eigenschaften des Transporters, welche die Selektivität für diese Inhibitoren bestimmen, außerhalb der eigentlichen Bindungsstelle zu finden sein könnten.

Ebenso wurde eine kinetische Analyse des Transport-Zyklus des Serotonin-Transporters durchgeführt; besonders intrazelluläre Bindungsreaktionen wurden studiert. Die entscheidenden Befunde lassen sich wie folgt zusammenfassen: (i) Die intrazelluläre Dissoziation des Na+ Ions ist elektrogen. (ii) Diese Elektrogenität wird durch Assoziation eines K+ oder H+ Ions kompensiert. (iii) Die intrazelluläre Cl- Konzentration hat keinen Effekt auf die Umsatzrate des Transporters. Diese Beobachtungen wurden mit Hilfe eines kinetischen Modells interpretiert; dieses bestätigt die Vermutung, dass der Cl- Gradient für die Substrattranslokation irrelevant ist und dass der Transporter seinen Zyklus in einer KCl oder HCl gebundenen Form beendet. Diese Eigenschaften des Serotonin-Transporters garantieren, dass er unter Prä-Äquilibriumsbedingungen spannungsunabhängig arbeitet.

Zusammenfassung (Englisch)

The monoamines dopamine, norepinephrine and serotonin are important neuromodulators in the human brain. Signaling via these neuromodulators is terminated by their reuptake into the presynaptic neuron via the plasmalemmal dopamine, norepinephrine and serotonin transporters (DAT, NET and SERT, respectively). These transporters are targets of a plethora of therapeutic and illicit drugs. Some of these drugs are inhibitors; others are substrates, which induce non-vesicular monoamine release via reversal of vectorial flux through the monoamine transporters. Some ligands display exquisite selectivity for one of these transporters. It is unclear how the monoamine transporters afford selective ligand binding and substrate transport.

Accordingly, I studied selective inhibitor recognition and the binding order, kinetics and voltage-dependence of substrate- and cosubstrate-binding to SERT by recording substrate-induced currents from HEK-293 cells expressing human SERT. The results presented in this thesis showed that selective transport inhibitors differed in their association rate constant rather than in their dissociation rate. These observations suggest that selectivity arises from the access pathway through the outer vestibule of the transporters rather than the binding site proper.

The kinetic analysis of the transport cycle of SERT revealed that the transporter was tuned to operate in a voltage-independent fashion in pre-steady-state conditions. This is achieved by electrogenic binding of intracellular K+ or H+, which cancels out highly electrogenic dissociation of intracellular Na+. In addition, SERT may not use the gradient of Cl- for substrate transport, because it completes the catalytic cycle in a KCl or HCl bound form. Taken together, the data described here provide insight into the kinetic determinants of selective ligand recognition and substrate and cosubstrate transport by the human serotonin transporter.