Titelaufnahme

Titel
Optimization of Chromatographic Methods for Simplification of Complex Biological Samples Prior to Proteomics Analysis / submitted by Andreas Fichtenbaum M.Sc.
Verfasser / VerfasserinFichtenbaum, Andreas
GutachterMitulovic, Goran
ErschienenWien, 10 / 2016
UmfangXI, 116 Seiten : Illustrationen, Diagramme
HochschulschriftMedizinische Universität Wien, Dissertation, 2016
Anmerkung
Zusammenfassung in deutscher Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Proteomik / MudPIT / ERLIC / HILIC / TiO2 / multidimensional / Chromatographie / RPLC / Massenspektrometrie / Evaluation
Schlagwörter (EN)Proteomics / MudPIT / ERLIC / HILIC / TiO2 / multidimensional / Chromatography / RPLC / Mass spectrometry / Evaluation
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-9638 Persistent Identifier (URN)
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Optimization of Chromatographic Methods for Simplification of Complex Biological Samples Prior to Proteomics Analysis [15.99 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Die Entdeckung neuer Protein-Biomarker aus biologischen Proben, die für therapeutische, diagnostische oder prognostische Zwecke eingesetzt werden, ist eine große Herausforderung im wissenschaftlichen Forschungsgebiet der „Proteomik“ und es ist ein langer Prozess bis zur klinischen Anwendung.

Die Massenspektrometrie (MS) ist die Schlüsseltechnologie für die Analyse und Identifikation von Proteinen aus „proteomischen“ Experimenten, da sie die höchste analytische Sensitivität aufweist. Dennoch fallen Proteine mit niedrigen stöchiometrischen Konzentrationen, sowie phosphorylierte Proteine häufig unter die Nachweisgrenze, wodurch potenzielle Protein-Biomarker nicht erkannt werden können. Deshalb ist es dringend erforderlich Prozesse der Probenvorbereitung und Methoden zu verbessern, um vor der massenspektrometrischen Analyse die Probenkomplexität zu vermindern, störende Hintergrundkomponenten zu entfernen und niedrig abundante Komponenten anzureichern. Das Proteome besteht aus Peptiden mit sehr unterschiedlichen chemischen Eigenschaften. Daher gibt es keine einzelne Trennmethode, welche den Anforderungen aller Peptid-Typen entspricht. Eine sensitive Analyse benötigt daher parallele Trennungen mit unterschiedlichen Methoden für die unterschiedlichen Proteine.

In dieser Studie wurden neue chromatographische Methoden entwickelt und validiert, um die Anreicherung und Trennung von Peptiden für proteomische Analysen biologischer Proben zu verbessern. Dafür wurden drei unterschiedliche Strategien angewendet: (i) Hydrophile Interaktions-Chromatographie (HILIC), (ii) elektrostatisch repulsive Interaktions-Chromatographie (ERLIC), und (iii) die Verwendung einer neuen monolithischen Säule mit immobilisierten Rutil nano-TiO2 [TiO tief2 ] Partikel. Schließlich wurde der on-line Transfer der Probe von der ersten Dimension (HILIC, ERLIC) zur RPLC-MS Analyse verbessert.

Im Rahmen der HILIC-Studie wurde eine mit nicht modifiziertem Kieselgel (silica) gepackte Trennsäule eingesetzt und die mobilen Phasen für die Auftrennung von polaren Peptiden optimiert. Das Potenzial der entwickelten chromatographischen Methode wurde anhand der Auftrennung von Peptiden eines tryptischen Verdaus von HeLa Proteinen veranschaulicht. Die Ergebnisse wurden mit einer 1-D Auftrennung der Peptide auf einer C18 RP-Säule verglichen. Es zeigte sich, dass die Anwendung des multidimensionalen Ansatzes deutlich höhere ProteinIdentifikationsraten im Vergleich zur 1-D Trennung. Darüber hinaus zeigte die Analyse der Peptide mit polaren Seitenketten, dass intra- und inter-molekulare Interaktionen auf der Kieselgel-Phase einen essentiellen Einfluss auf den Retentions-Mechanismus der Peptide ausüben.

Im Rahmen der ERLIC Studie wurden zwecks Verbesserung der Auftrennung und Identifikation von Peptiden unterschiedliche Mobile Phase Bedingungen getestet. Das Ergebnis zeigte, dass die höchste Trenn-Leistungsfähigkeit auf einer schwachen Anionen-Austauschsäule (WAX) und unter Einsatz der Mobilen Phase A mit dem niedrigsten Anteil an wässrigem Puffer (90%ACN, 10mM MPh, pH2) erzielt wurde.

In einer weiteren Studie wurde eine neue monolytische Säule, die immobilisierte rutile nano-TiO2 [TiO tief2 ] Partikel beinhaltet, auf ihre Fähigkeit der spezifischen Bindung und Anreicherung von phosphorylierten Peptiden getestet. Die spezifische Bindungsfähigkeit von Phosphopeptiden der Säule wurde anhand des Einsatzes von tryptisch verdauten bovinem α-casein und Proteinen eines HeLa Zell-Lysates bestätigt. Die Verwendung dieser neuen Säule könnte für ein multidimensionales On-line-System (z.B.: ERLIC-TiO2 [TiO tief2 ] -RPLC-MS, SCX-TiO2 [TiO tief2 ] -RPLC-MS) nützlich sein, um Identifikationsraten und die Sequenzabdeckung von phosphorylierten Stellen zu erhöhen.

Im Großen und Ganzen weisen die in dieser Arbeit beschriebenen chromatographischen Methoden ein großes Potenzial für die Verwendung in einem multidimensionalen Trennsystem auf. Daher war es schließlich das Ziel die Herausforderung der Lösungsmittelinkompatibilität, beim On-line Transfer der Probe aus der ersten Trenndimension (HILIC, ERLIC) auf die RPLC-MS Analyse, anzugehen. Das Problem dieser Inkompatibilität wurde erfolgreich gelöst, indem vor dem Beladen von 10μl-20μl Probenfraktionsvolumen auf die C18-Trap-Säule der zweiten Dimension eine 500μl Puffer Kapillare installiert wurde.

Auf Basis dieser finalen Ergebnisse könnte jede der im Rahmen dieser Dissertation optimierten HPLC Trennbedingungen eingesetzt und in einem online multidimensionalen Trennsystem implementiert werden, so wie es im letzten Kapitel dieser Arbeit vorgeschlagen wird. Zukünftige Experimente könnten neue Konzepte für die Anwendung von online multidimensionalen Trennsystemen beinhalten, die zum Beispiel anwendbar sind für: HILIC-RPLC-MS, ERLIC-RPLC-MS oder ERLIC-TiO2 [TiO tief2 ] -RPLC-MS.

Zusammenfassung (Englisch)

The discovery of protein biomarkers from biological samples for therapeutic, diagnostic or prognostic purposes is a challenging task in the scientific field of proteomics and a long-term process until clinical usage.

Mass spectrometry (MS) is the key technology for protein analysis and identification with proteomic experiments providing highest sensitivity. Nevertheless, low abundant and phosphorylated proteins often fall below the detection limit and potential protein biomarkers might not be detected at all. Therefore, improvement of sample processing steps and methodologies is crucial in order to reduce sample complexity, remove the background noise, and enrich low abundant components prior to mass spectrometric analysis. The proteome consists of peptides with very different chemical properties. Thus, there is no single separation method that fulfils the requirements for all types of peptides. A sensitive analysis needs therefore parallel separations with different methods for different proteins.

In this study we developed and validated novel chromatographic methods to improve the enrichment and separation of peptides for the proteomic analysis of biological samples. We applied three different strategies: (i) Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC), (ii) Electrostatic Repulsion Interaction Chromatography (ERLIC), and (iii) a new monolithic column comprising rutile nano-TiO2 [TiO tief 2] particles. Finally we improved the on-line sample transfer from the first separation (HILIC, ERLIC) dimension to RPLC-MS analysis.

For the HILIC study, a column packed with unmodified silica was employed and the mobile phases used for separation of peptides were optimized. The potential of the developed chromatographic method was exemplified on separating peptides from tryptic digest of HeLa proteins. Clearly, the use of the multidimensional HILIC-RPLC-MS separation approach yielded with significantly higher identifications compared to the 1-D separation. Moreover, current results for analyzed peptides with different polar side chains showed that intra- and inter-molecular interactions on the silica phase might have crucial influence on peptides retention mechanism.

For the ERLIC study, different mobile phase conditions were tested for improvements in peptide separation and identification. It was found that the best separation performance was achieved on a weak anion exchange column (WAX) when mobile phase A, the loading mobile phase, contained the lowest amount of aqueous buffer, in this case: 90%ACN, 10mM MPh, pH2.

Another study part was the employment of a new monolithic column comprising rutile nano-TiO2 [TiO tief 2] particles and the assessment of its ability for the specific enrichment of phosphorylated peptides. Phosphopeptide trapping using TiO2 [TiO tief 2] immobilized on a monolithic support was confirmed upon application of tryptic digest of α-casein and proteins from the HeLa cell lysate. Employment of this novel column for an automated online multidimensional approach (e.g.: ERLIC-TiO2 [TiO tief 2]-RPLC-MS, SCX-TiO2 [TiO tief 2]-RPLC-MS) might be useful for increasing identification rates and higher coverage of phosphorylation sites.

In general, described chromatographic modes comprise great potential for the use in a multidimensional separation system. Thus, the final goal was addressing the challenge of solvent incompatibility upon on-line sample transfer from the first separation (HILIC, ERLIC) dimension to RPLC-MS analysis. This incompatibility issue was successfully overcome by using a 500μl buffer loop prior to loading 10μl-20μl of sample fraction volumes to the second dimension C18 trap column.

Based on final results, any optimized HPLC separation condition examined in this thesis might be employed and implemented into an online multidimensional separation approach as proposed here. Future experiments might employ new concepts for an online multidimensional separation system, applicable for HILIC-RPLC-MS, ERLIC-RPLC-MS or ERLIC-TiO2 [TiO tief 2]-RPLC-MS.