Titelaufnahme

Titel
The influence of EWS-FLI1 on the Rho/MRTF/actin circuit in Ewing sarcoma / submitted by Anna Maria Katschnig, MSc
Verfasser / VerfasserinKatschnig, Anna
Betreuer / BetreuerinKovar, Heinrich
ErschienenWien, 02/2017
UmfangXII, 98 Seiten : Illustrationen
HochschulschriftMedizinische Universität, Dissertation, 2017
Anmerkung
Zusammenfassung in deutscher Sprache
Datum der AbgabeJuni 2017
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)EWS-FLI1 / Ewing Sarkom / Rho / MRTF / Aktin
Schlagwörter (EN)Ewing sarcoma / EWS-FLI1 / Rho-pathway / actin / MRTF / SRF / YAP / TEAD / ChIP-seq / RNA-seq / Confocal microscopy
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-10422 Persistent Identifier (URN)
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The influence of EWS-FLI1 on the Rho/MRTF/actin circuit in Ewing sarcoma [5.79 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Das Ewing Sarkom ist ein hoch-aggressiver pädiatrischer Tumor, welcher durch die Expression des Fusionsproteins EWS-FLI1, das Produkt der chromosomalen Translokation t(11;22)(q24;q12), angetrieben wird. EWS-FLI1 ist ein entarteter Transkriptionsfaktor, der die Expression hunderter Gene verändert, indem er sie entweder aktiviert (EWS-FLI1 korrelierte Gene) oder reprimiert (EWS-FLI1 antikorrelierte Gene). Unter den EWS-FLI1-antikorrelierten Genen befindet sich eine Vielzahl an Genen für zytoskeletale Komponenten, die normalerweise über den Rho/F-Aktin Signalweg reguliert werden. Der Rho Signaltransduktionsweg ist für die koordinierte Regulation des Aktin-Zytoskeletts und damit für die zelluläre Verformbarkeit hauptverantwortlich. Tumorzellplastizität ist eine Grundeigenschaft der malignen Zelle um zu metastasieren. EwS Zellen metastasieren sehr effizient und üblicherweise noch bevor der Tumor klinisch detektierbar ist. Aus diesem Grund studierten wir den möglichen Einfluss von EWS-FLI1 auf den Rho Signalweg bei der EwS Metastasierung. Wenn Rho GTPasen aktiviert werden, katalysieren sie über ihre Effektoren die Polymerisierung von globulärem (G) Aktin zu filamentösem (F) Aktin. In direkter Folge kann der Myokardin-verwandte Transkriptionsfaktor MRTF in den Kern transloziieren. Zu den MRTFs gehören MRTFA (MKL-1) und MRTFB (MKL-2), welche im Kern üblicherweise an den Serum aktivierten Faktor SRF binden und als Koaktivatoren die Transkription von zytoskeletalen Genen regulieren. In dieser Studie arbeiteten wir mit einer EwS Zelllinie, A673/TR/shEF, bei der die Expression von EWS-FLI1 durch die Zugabe von Doxyzyklin (Dox) effizient reduziert werden kann. Es zeigte sich, dass EWS-FLI1 die transkriptionelle Aktivität von MRTFA/B stark unterdrückte, was sich in einer entgegensetzten Regulation von EWS-FLI1 kontrollierten Genen nach Modulation von MRTFA, vorallem aber MRTFB manifestierte. Chromatin-Immunoprezipitation mit Antikörpern gegen MRTFB und EWS-FLI1 und darauf folgender Sequenzierung (ChIP-seq) zeigte starke Überlappungen im chromosomalen Bindeverhalten der beiden Transkriptionsfaktoren. Wir fanden, dass MRTFB bevorzugt an distalen transkriptionsverstärkenden Regionen (“Enhancer”) von EWS-FLI1-antikorrelierten Genen bindet. Herabsetzung von EWS-FLI1 verstärkte diese Assoziation. Unter den mit MRTFB Enhancer Bindung assoziierten Genen befand sich eine Vielzahl von Genen, welche üblicherweise über den YAP/TAZ/TEAD Signalweg reguliert sind (CTGF, CYR61, SERPINE1). Tatsächlich konnten wir zeigen, dass auch in EwS TEAD Faktoren an die distalen Regionen der EWS-FLI1-antikorrelierten Gene binden und ähnlich MRTFB der transkriptionellen Aktivität von EWS-FLI1 entgegenwirken. Zusätzlich fanden wir auch eine signifikante Anreicherung des TEAD Koaktivators YES-assoziiertes Protein YAP-1 an den distalen MRTFB/TEAD gebundenen Regionen. Während EWS-FLI1 Reduktion die Bindung des Fusionsproteins an die jeweiligen Regionen verminderte, wurde die Bindung von MRTFB dort verstärkt. Besonders hervorzuheben ist, dass viele der gemeinsamen aber entgegengesetzt regulierten MRTFB/TEAD/EWS-FLI1 Zielgene eine wichtige Rolle in der Modulierung des Zytoskeletts einnehmen. So befanden sich darunter sowohl Gene, die für die Kommunikation der Zelle mit der extrazellulären Matrix (CYR61, CTGF) verantwortlich sind, als auch Gene, welche direkt die Stabilität und Integrität des Zytoskeletts beeinflussen (TPM-1, TAGLN, CALD-1). Unsere Daten stützen daher die Hypothese, dass die sich selbstregulierende zytoskeletale Rückkoppelungsschleife von EWS-FLI1 unterbrochen wird, indem es die Bildung eines transkriptionellen Modules von MRTFB, YAP-1 und TEAD verhindert.

Zusammenfassung (Englisch)

Ewing sarcoma (EwS) is a highly aggressive paediatric bone tumour driven by the ETS fusion-oncogene EWS-FLI1, derived from the chromosomal translocation t(11;22)(q24;q12). EWS-FLI1 fuels EwS pathogenesis mainly by its function as an aberrant transcription factor which deregulates hundreds of genes by either activation (EWS-FLI1-correlated genes) or repression (EWS-FLI1-anticorrelated genes). Several EWS-FLI1-anticorrelated genes are involved in cytoskeletal processes and typically regulated by Rho/F-actin signalling. The Rho pathway is a crucial regulator of the actin cytoskeleton and cellular plasticity, which is a prerequisite of tumour cells in order to become metastatic. Given the fact that EwS cells are highly prone to metastasize we were interested in studying a potential EWS-FLI1-mediated deregulation of Rho signalling. Activation of Rho triggers globular (G)- to filamentous (F)-actin polymerization thereby enabling nuclear translocation of the myocardin-related transcription factors MRTFA (MKL-1) and MRTFB (MKL-2). MRTFs typically serve as transcriptional co-activators of the transcription factor SRF in regulating several cytoskeletal key players. We used the A673/TR/shEF cell line, where EWS-FLI1 levels can be easily modulated upon doxycycline (dox) addition, as a model to study the influence of EWS-FLI1 on MRTFA/B in EwS. Strikingly, MRTFA/B transcriptional activity was overall repressed by EWS-FLI1. MRTFA and especially MRTFB depletion antagonized transcriptional effects of the dox-induced EWS-FLI1 knockdown. Chromatin-immunoprecipitation coupled with sequencing (ChIP-seq) revealed a strong overlap of MRTFB and EWS-FLI1 chromatin binding. MRTFB binding was significantly enriched in distal (enhancer) regions of EWS-FLI1-anticorrelated genes, especially upon EWS-FLI1-low conditions. Of note, an overrepresentation of TEAD motifs, but not SRF binding motifs, was observed in these regions suggesting a potential involvement of TEAD transcription factors in the regulation of the MRTFB/EWS-FLI1 reciprocally regulated targets. In line with this finding, target genes of the mechano sensitive YAP/TAZ/TEAD pathway (CTGF, CYR61, SERPINE1) were found among the MRTFB-bound EWS-FLI1-anticorrelated genes. Genome-wide expression profiling upon combined knockdown of EWS-FLI1 and all four TEADs confirmed that TEAD regulates EWS-FLI1 target genes antagonistically. ChIP-qPCR for selected genes validated binding of TEAD and its transcriptional co-activator YAP-1 to MRTFB/EWS-FLI1 target genes. Whereas chromatin occupancy of EWS-FLI1 was reduced upon low-EWS-FLI1 levels, MRTFB binding was enriched. Among this panel of target genes we found several keyplayers of cytoskeletal signalling (CYR61, CTGF) and remodelling (TPM-1, TAGLN, CALD-1). Our data suggest a model in which EWS-FLI1 disrupts formation of a transcriptional MRTFB/YAP-1/TEAD module thereby perturbing the cytoskeletal autoregulatory feedback loop.