Titelaufnahme

Titel
Toleranzentwicklung bei humanen parodontalen Ligamentzellen durch Stimulierung mit TLR2-Agonist / eingereicht von Tobias Salfinger
Weitere Titel
Development of tolerance in human periodontal ligament cells by stimulation with tlr-2 agonist
Verfasser / VerfasserinSalfinger, Tobias
GutachterAndrukhov, Oleh
Erschienen2017
Umfang115 Blatt : Illustrationen, Diagramme
HochschulschriftMedizinische Universität Wien, Diplomarbeit, 2017
Anmerkung
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Datum der AbgabeJuli 2017
SpracheDeutsch
DokumenttypDiplomarbeit
Schlagwörter (DE)Parodont / Ligament / TLR-2 / Pam3CSK4
Schlagwörter (EN)periodont / ligament / TLR-2 / Pam3CSK4
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-11588 Persistent Identifier (URN)
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Toleranzentwicklung bei humanen parodontalen Ligamentzellen durch Stimulierung mit TLR2-Agonist [2.75 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Die Parodontitis ist eine multifaktoriell bedingte chronische Entzündung des Zahnhalteapparates. Unter Endotoxintoleranz (ET) versteht man einen von Immunzellen und anderen Zytokin- exprimierenden Zellen etablierten Schutzmechanismus, bei dem eine wiederholte Pathogen-Belastung zu einer Reduktion der Zytokine IL-6, IL-8, MCP-1, TLR2, TLR4, und somit zu einer Verminderung der Entzündung führt. Bislang unerforscht ist, ob PDL-Zellen durch eine Vorstimulierung mit dem TLR2-Agonisten Pam3CSK4 in submaximaler Konzentration einen Endotoxintoleranz ähnlichen Zustand entwickeln.

Zielsetzung

Ziel dieser Diplomarbeit war es im Zuge von in vitro Versuchen zu erforschen, ob eine Vorstimulierung humaner PDL-Zellen mit Pam3CSK4 als TLR2-Agonist die Amplitude der Zellreaktion nach anschließender Stimulierung mit weiteren Stimuli beeinflusst.

Methodik

Primäre humane parodontale Ligamentzellen (hPDL) von fünf verschiedenen Donoren wurden kultiviert und mit Pam3CSK4 in submaximaler Konzentration vorstimuliert. Anschließend erfolgte eine weitere Stimulierung mit dem TLR2-Agonisten Pam3CSK4, Escherichia coli (E.coli) LPS als TLR4-Agonist und Porphyromonas gingivalis (P.gingivalis) LPS in höheren Konzentrationen. Die Zellreaktion wurde anhand der Messung der Genexpression von Interleukin (IL)-6, IL-8 und Monozyten-chemotaktischen Protein (MCP-1) durch qPCR und mittels der Ermittlung der Proteinkonzentration aus Zellkultur-Überständen durch ELISA durchgeführt. Zusätzlich wurde die Genexpression von TLR2 und TLR4 durch qPCR gemessen. Die Reaktion vorstimulierter Zellen wurde mit jener ohne Vorstimulation verglichen.

Resultate

Die Vorstimulation humaner PDL-Zellen mit Pam3CSK4 in submaximaler Konzentration führte zu einer anhaltenden Zunahme der IL-6 und MCP-1 Produktion. Die Expression entzündlicher Mediatoren war in allen vorstimulierten Gruppen signifikant höher als in den Vergleichsgruppen ohne Vorstimulation. Die Stimulierung vorstimulierter Zellen mit Pam3CSK4 führte zu einer weiteren Steigerung der Zytokinproduktion. Die Stimulation vorstimulierter Zellen mit LPS in unterschiedlichen Konzentrationen ergab eine statistisch nicht signifikante geringfügig geringere Zytokinexpression verglichen zur vorstimulierten Kontrollgruppe. Die Stimulation nicht-vorstimulierter Zellen mit Pam3CSK4 und P. gingivalis LPS führte zur einer statistisch signifikanten gesteigerten Zytokinproduktion. Die Zellreaktion vorstimulierter Zellen war im Vergleich zu jener der nicht-vorstimulierten Zellen geringer. Dieser Unterschied ist jedoch statistisch nicht signifikant. Vorstimulierte Zellen zeigten ein signifikant gesteigertes TLR2-Expressionsniveau. Es konnte keine Beziehung der Genexpression von TLR2 und TLR4 beobachtet werden.

Konklusion

Eine Vorstimulation humaner PDL-Zellen mit dem TLR2-Agonisten Pam3CSK4 in submaximaler Konzentration scheint die Reaktionsfähigkeit der Zellen auf P. gingivalis LPS zu beeinflussen. Dies kann durch die Tatsache, dass die Vorstimulierung auch nach der Entfernung des TLR2-Agonisten eine anhaltende Entzündung der Zellen induziert, erklärt werden. Die Vorstimulation hatte keinen Einfluss auf die Reaktion humaner PDL-Zellen auf höhere Konzentrationen des Pam3CSK4. Zusammenfassend deuten die Daten darauf hin, dass die Vorstimulierung humaner PDL-Zellen mit einem TLR2-Agonisten vermutlich keinen immuntoleranten Zustand dieser Zellen einleitet. Die Aktivierung des TLR2 könnte für eine nachhaltige Entzündung im Rahmen einer Parodontalerkrankung verantwortlich sein.

Zusammenfassung (Englisch)

Periodontitis is a multifactorial chronic inflammation of the tooth supporting tissue, characterized by destruction of the soft and hard tissue and eventually tooth loss. Endotoxin tolerance (ET) is understood as a protective mechanism established by immune cells and other cytokine-expressing cells, in which a repeated pathogen loading leads reduced cytokine production of IL-6, IL-8, MCP-1, TLR2, TLR4 Zytokine. That leads to a reduced inflammation. It has not yet been investigated whether PDL cells prestimulated submaximally with the toll-like receptor (TLR) 2-agonist Pam3CSK4 develop a similar endotoxin-tolerant state.

Aim

The aim of this diploma thesis was to investigate whether a pre-stimulation of human PDL cells with TLR2-agonist Pam3CSK4 influences the amplitude of their response upon subsequent stimulation different stimuli.

Methods

Primary human periodontal band (hPDL) cells from five different donors were cultured and pre-stimulated for 24 hours with TLR2 agonist Pam3CSK4 in submaximal concentration. Subsequently stimulation with higher concentration of Pam3CSK4, Escherichia coli LPS as TLR4-agonist and Porphyromonas gingivalis LPS was carried out for a further 24 hours. Cell response was evaluated based on the measurements of interleukin (IL)-6, IL-8, and monocyte chemotactic protein (MCP-1) expression on gene and protein levels, which were measured by qPCR and ELISA, respectively. In addition, gene expression levels of TLR2 and TLR4 was measured by qPCR. The response in pre-stimulated cells was compared with that in cells without any pre-stimulation.

Results

Prestimulation of hPDLC with submaximal Pam3CSK4 concentration resulted in sustained increase of IL-6, IL-8, and MCP-1 production. The expression levels of all inflammatory mediators was significantly higher in all pre-stimulated group compared to groups without pre-stimulation. In prestimulated cells, second stimulation with higher concentrations of Pam3CSK4 resulted in further increase of cytokine production. Stimulation of these cells with all LPS resulted even in slightly lower cytokine expression levels compared to prestimulated control cells, but these differences were not statistically significant. In cells without prestimulation, second stimulation with Pam3CSK4 and P. gingivalis LPS resulted in significant increase of all inflammatory mediators. The response to LPS in pre-stimulated cells was lower compared to non prestimulated cells, but these differences were not statistically significant. Prestimulated cells exhibited significantly higher expression levels of TLR2.No relationship between TLR2 and TLR4 expression levels and cytokine production was observed.

Conclusion

Prestimulation of PDL cells with submaximal concentration of TLR2 agonists Pam3CSK4 seem to influence the responsiveness of these cells to P. gingivalis LPS. This can be accounted by the fact that prestimulation with Pam3CSK4 induces sustained inflammation in these cells even after removing of the ligand. Pre-stimulation had no effect on the PDLs response to higher concentrations of TLR2 agonist. Summarizing, the data suggest that prestimulation of PDLC with TLR2 ligand hardly induce immune tolerant state. TLR2 activation might be responsible for sustained inflammation on periodontal disease.