Titelaufnahme

Titel
The genetic PNPLA3 variant I148M promotes liver fibrosis development by enhancing inflammatory and fibrogenic properties of human hepatic stellate cells
Verfasser / VerfasserinBruschi, Francesca Virginia
GutachterTrauner, Michael
Erschienen2017
Umfang88 Blatt
HochschulschriftMedizinische Universität Wien, Diss., 2017
Anmerkung
Arbeit an der Bibliothek noch nicht eingelangt - Daten nicht geprüft
Datum der AbgabeJuni 2017
SpracheEnglisch
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Leberfibrose, / genetische Variante / Sternzelle / Entzündung / Fibrose / Zytokine / nukleäre Rezeptoren
Schlagwörter (EN)genetic polymorphism / hepatic inflammation / liver fibrosis / lipid metabolism / PPAR
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-10583 Persistent Identifier (URN)
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The genetic PNPLA3 variant I148M promotes liver fibrosis development by enhancing inflammatory and fibrogenic properties of human hepatic stellate cells [11.81 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Die nichtalkoholische Fettlebererkrankung umfasst ein breites Spektrum von Leberpathologien, die maßgeblich durch eine krankhafte Akkumulation von Triglyzeriden in Hepatozyten charakterisiert werden. Im Verlauf der Krankheit kommt es zur nichtalkoholischen Steatohepatitis, Leberfibrose und schlussendlich Leberzirrhose. In all diesen Stadien kann bereits ein Leberzellkarzinom auftreten. Der zur Zeit wichtigste genetische Risikofaktor ist das Adiponutrin Gen (PNPLA3) und dessen Polymorphismus rs738409 (PNPLA3 I148M). Patienten, welche diese Variante tragen, leider nicht nur eher an der Fettleber, sondern deren Erkankung schreitet auch deutlich rascher voran. Die normale enzymatische Funktion von PNPLA3 ist noch nicht geklärt. Daher könnte der I148M Polymorphismus entweder in einem Funktionsverlust oder einem Funktionsgewinn resultieren. Zudem haben in vitro sowie in vivo Studien noch keinen mechanistischen Aufschluss über die Rolle des I148M Polymorphismus in der Krankheitsprogression von einer simplen Steatose zu einer NASH oder weiter fortgeschritten Stadien ergeben. Nachdem die Leberfibrose ein Schlüsselstadium in der Erkrank Progression zur Leberzirrhose darstellt, ist das Ziel meiner Doktorarbeit, die Funktion von PNPLA3, sowie dessen genetischer Variante in der Leberfibrogenese zu analysieren. Aktivierte hepatische Sternzellen (HSC) tragen maßgeblich zu diesem Fibrosierungsprozess der Leber bei. Bisher wurde die Rolle von PNPLA3 in in vitro aktivierten HSCs noch nicht analysiert. Meine Forschungsarbeit zeigte, dass eine vollständige Aktivierung primärer humaner HSCs PNPLA3 benötigt. Eine verminderte Expression von PNPLA3 bewirkte eine reduzierte fibrosierende Aktivität dieser Zellen. Ein direkter Vergleich von Wildtyp PNPLA3 exprimierender primärer humaner HSC mit Zellen der PNPLA3 Variante I148M produzierenden Zellen zeigte, dass HSC mit dem I148M Polymorphismus größere Mengen an pro-inflammatorischer und pro-fibrosierender Zytokine, wie zum Beispiel CCL5 und GM-CSF bildeten. Dies führte in weiterer Folge zu einer vermehrten Rekrutierung von Monozyten und Makrophagen. Um unsere Resultate mit den primären Zellen zu bestätigen, generierten wir stabile LX-2 Zelllinien, die entweder die Wilttyp oder die I148M Variante von PNPLA3 überexprimierten. Die I148M Variante überexprimierende Zelllinie bestätigte die pro-inflammatorischen und pro-fibrosierenden Charakteristika der primären humanen HSCs. Die Analyse des sezernierten Zytokinprofiles zeigte, dass die I148M Variante überexprimierenden LX-2 Zellen zusätzlich zu CCL5 und GM-CSF andere pro-inflammatorische Zytokine freisetzten. In den I148M PNPLA3 produzierenden HSC und LX-2 Zellen wurde im Vergleich zu den Wildtyp PNPLA3 bildenden Zellen eine signifikant größere Anzahl an Lipidtröpfchen sowie ein geringerer Retinol Gehalt ermittelt. Daher wurde die Regulation der Expression von nukleären Rezeptoren, die an der Aktivierung der HSC beteiligt sind, wie zum Beispiel Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma (PPAR), Retinoid X Receptor (RXR) und Retinoic Acid Receptor (RAR), anhand Messungen der Promotoraktivität, ermittelt. Die Präsenz der I148M Variante korrelierte mit einer reduzierten Luziferaseaktivität der Response-Elemente DR-1, DR-2 und DR-5. Außerdem, war die DNA-Bindungseffizienz von PPAR, aufgrund der von c-Jun aktivierten Kinase (JNK) durchgeführten Phosphorylierung an der inhibitorischen Stelle von PPAR, reduziert. Die Aktivator-Protein-1 (AP1) Luziferaseaktivität war in I148M überexprimierenden LX-2 Zellen signifikant erhöht. Dies könnte eine Erklärung für den pro-fibrosierenden Charakter der HSC mit der genetischen I148M Variante sein. In meiner Forschungsarbeit wurde eine mögliche molekularer Erklärung für die Progression von nichtalkoholischen Steatosen zu Steatohepatitis dargestellt. Diese kann möglicherweise zur zukünftigen Entwicklung neuer zielgerichteter Therapien beitragen.

Zusammenfassung (Englisch)

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) comprises a group of liver pathologies in which the hallmark is an aberrant accumulation of triglycerides in hepatocytes. These disorders mostly derive from metabolic abnormalities, such as obesity, type II diabetes and from genetic risk factors. Among the factors determing susceptibility and progression across the disease spectrum, the genetic polymorphism of the human Adiponutrin gene rs738409, known also as PNPLA3 I148M, represents one of the most recently studied and of highest relevant determinants for pathogenesis and progression of NAFLD in the last years, since it has been shown to be associated with simple steatosis and progression towards non-alcoholic steatohepatitis (NASH), liver fibrosis and cirrhosis. The enzymatic role of this protein is still uncertain: some studies reported a lipase activity, while others showed lysophosphatidic properties, accordingly the I148M would result either as loss or gain of function. Moreover, both in vitro and in vivo studies have so far been lacking to understand the molecular and cellular mechanisms how the I148M variant contributes to the progression from simple steatosis to more advanced liver injury. Therefore, the aim of my doctoral thesis was to investigate the specific input of PNPLA3 and its genetic variant in the mechanisms of liver fibrogenesis, which represents the key step toward severity of NAFLD development, such as NASH and later cirrhosis. In this view, hepatic stellate cells (HSCs) are the main responsible of the scarring process which characterizes liver fibrosis and, notably, so far nobody investigated on the role of PNPLA3 during HSCs in vitro activation. My research revealed that primary human HSCs require PNPLA3 for achieving a fully activated phenotype and its repression was related to less fibrogenic activity. Moreover, a comparison between primary human HSCs expressing the wild type (WT) PNPLA3 and the I148M isoform showed that cells carrying the variant express significantly higher amount of pro-inflammatory and pro-fibrogenic cytokines, compared to their WT counterpart, such as the chemokine C-C motif ligand 5 (CCL5) and the granulocyte and macrophages colony stimulating factor (GM-CSF), consequently contributing to immune cells recruitment in the site of injury. To confirm our findings in primary cells, we generated a stable cell line overexpressing either the WT or the I148M PNPLA3 isoforms using LX-2 cells, a human immortalized HSC cell line. Interestingly, LX-2 overexpressing the PNPLA3 genetic variant recapped the pro-inflammatory and pro-fibrogenic features showed by primary human HSCs. Moreover, medium cytokine profile analysis revealed that, in addition to CCL5 and GM-CSF, other pivotal pro-inflammatory cytokines are released in the medium collected from LX-2 overexpressing the I148M isoform, such as the chemokine C-C motif ligand 2 (CCL2), the chemokine C-X-C motif ligand 1 and 8 (CXCL1, CXCL8). Interestingly, both primary human HSCs and LX-2 expressing the I148M PNPLA3 showed also significantly higher lipid droplet (LD) amount and lower retinol content, when compared to WT PNPLA3 expressing cells. Therefore, by analyzing the regulation and DNA specific binding of some anti fibrotic nuclear receptors, such as the proliferator-activated receptor gamma (PPAR), the retinoid X receptor (RXR) and the retinoic acid receptor (RAR), we found that both primary HSCs and LX-2 carrying the I148M variant display significantly reduced transcriptional activity of all those corresponding nuclear receptor response elements DR-1, DR-2 and DR-5, as indicated by luciferase and gel-shift assays.