Titelaufnahme

Titel
Interdomain communication of the bile salt export pump, an ATP-binding cassette transporter associated with intrahepatic cholestasis
Verfasser / VerfasserinSohail, Muhammad Imran
GutachterChiba, Peter
Erschienen2017
Umfangxv, 113 Blatt
HochschulschriftMedizinische Universität Wien, Diss., 2017
Anmerkung
Arbeit an der Bibliothek noch nicht eingelangt - Daten nicht geprüft
Datum der AbgabeJuli 2017
SpracheEnglisch
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)BSEP / Cholestasis / ABC-transporter
Schlagwörter (EN)BSEP / Cholestasis / ABC-transporter
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-10728 Persistent Identifier (URN)
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Interdomain communication of the bile salt export pump, an ATP-binding cassette transporter associated with intrahepatic cholestasis [5.63 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Der Gallensalztransporter BSEP ist für den Transport von Gallensalzen aus den Leberzellen in die Galle verantwortlich. Eine Funktionsbeeinträchtigung führt zu intrahepatischer Cholestase und Leberschädigung. Die verebte Form der Erkrankung ist eine Folge von Mutationen im Gen des Transporters. Die erworbene Form tritt häufiger und als Folge der systemischen Verabreichung von Medikamenten auf. Das Wissen über die Wechselwirkung von BSEP mit Arzneistoffen ist begrenzt. Dies betrifft auch die Kommunikation zwischen den einzelnen Domänen des Proteins im Rahmen des katalytischen Zyklus. Das Ziel dieser Arbeit war eine biochemische Charakterisierung des Effekts der Mutation von Sequenzmotiven in den Nukleotidbindungsdomänen. Dafür wurden BSEP-Mutanten hergestellt und auf diese Weise die Kommunikation zwischen den einzelnen Domänen des Proteins charakterisiert. Die Strategie zur Auswahl der zu verändernden Aminosäurereste basierte auf einem Vergleich der NBD-NBD Kontaktfläche der vier Transporter der ABCB Subfamilie, deren Domänen in einer singulären Polypeptidkette kodiert werden. Diese Reste sind ident, bis auf vier Aminosäuren in NBS1 von BSEP. Es handelt sich hierbei um folgende Aminosäuren: ein Methionin anstelle eines Glutaminsäurerestes in Position 584, eine Glutaminsäure anstelle von Serin in Position 502 und ein Arginin und eine Glutaminsäure anstelle eines Glycins und eines Glutamins in Positionen 1221 und 1223. In den ersten Experimenten wurden zwei Mutanten näher charakterisiert. Die M584E Mutante zeigte 90 Prozent der Transportaktivität des Wild-Typs, während die E502S/M584E/R1221G/E1223Q Vierfachmutante 35 Prozent der Transportaktivität des Wildtyps zeigte. Die geringere Transportaktivität der Mutanten korrrelierte mit einer gleichläufigen Abnahme der basalen ATPase Aktivität. Im nächsten Schritt wurden die kanonischen Lysinreste der Walker A Motive beider Nukleotidbindungsstellen (NBS) zu Methionin mutiert. Erwartungsgemäß führten diese Mutationen zu einem vollständigen Verlust der Transportaktivität des Proteins, unabhängig davon welche NBS mutiert wurde. Des Weiteren wurden die Asparaginsäure beider D-Loops zu Alanin mutiert. Die Mutation in der kanonischen NBS2 (D590A) führte zu einem vollständigen Verlust der Transportaktivität, während die analoge Mutation in NBS1 (D1250A) nur eine 50 prozentige Verringerung zur Folge hatte. Im nächsten Schritt wurde das katalytische Glutamat aus NBD2 entfernt und in NBD1 anstelle des Wildtyp-Methionins eingesetzt. Die daraus resultierende M584E/E1244Q Doppel-Mutante zeigte eine residuelle Transportaktivität von 15% des Wildtyps. Eine kinetische Modellierung der experimentellen Daten zeigte, dass die M584E/E1244Q-Doppelmutante die Charakteristika eines aktiven Transporters verlor und als ATP-gesteuerter erleichterter Diffusionstansporter arbeitete. Nach unserem Wissensstand stellt dies einen Präzedenzfall für ABC-Proteine mit einer nichtkanonischen Nukleotidbindungsstelle dar.

Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die Fähigkeit verschiedener Verbindungen, den Transport von Taurocholate zu inhibieren, untersucht. Diese Moleküle wurden in silico, basierend auf ihren physikochemischen Eigenschaften, als potentielle Inhibitoren von BSEP prognostiziert. Die sieben Verbindungen mit den besten Vorhersagewerten wurden ausgewählt und experimentell auf deren Fähigkeit BSEP zu hemmen untersucht. Die Ergebnisse zeigen, daß Bromocriptin den Transport von Taurocholat inhibiert.

Diese Arbeit stellt einen weiterer Schritt zum Verständnis des molekularen Mechanismus des Taurocholattransports durch BSEP dar und ist sowohl ein Ausgangspunkt für die Untersuchung der Substratbindungsstelle als auch für die Identifizierung von Aminosäuren, die für die Interaktion mit niedrigmolekularen chemischen Entitäten verantwortlich sind.

Zusammenfassung (Englisch)

The bile salt export pump (ABCB11/BSEP) is responsible for the vectorial transport of bile salts from hepatocytes into bile canaliculi. Its malfunction is associated with intrahepatic cholestatic liver diseases, which are either inherited or acquired. The former is caused by mutation in the gene encoding BSEP. The latter occurs due to side-effects of systemically administered drugs. A wealth of literature has been generated to characterise mutation-induced misfolding and attempts are being undertaken to rescue such mutants to the plasma membrane. Furthermore, the drugs are screened at pre-clinical and clinical levels for their potential interaction with BSEP. However, our knowledge about the structure-function relationship and interdomain communication of this transporter is limited. Hence, the current study focused on the biochemical characterisation of protein motifs. For that we engineered the transporter in order to dissect the domain communication paths. The mutation strategy was based on a comparison of the NBD-NBD contact interface of all four full transporters of ABCB subfamily. It showed complete conservation except for four residues, which are all located in NBS1. In BSEP, these residues are: a methionine instead of a catalytic glutamate in the Walker B motif (M584), a glutamate instead of serine next to the eponymous glutamine of the Q loop (E502), and an arginine and a glutamate instead of glycine and glutamine in the signature motif of the opposing NBD2 (R1221, E1223), respectively. In first series of experiments we generated the M584E single and the E502S/M584E/R1221G/E1223Q quadruple mutant. The single M584E mutant showed 90 percent of wild-type transport activity. Taurocholate transport in the quadruple mutant decreased to approximately 35 percent as compared to wild-type protein. The decrease in basal ATPase activity in the mutants conformed to the decrease in transport activity. Then, we mutated canonical lysine residues of the Walker A motif of NBS1, as well as NBS2 to methionine. Not unexpectedly, the substitution of the Walker A lysine abolished transport activity, regardless the NBS where it was mutated. Furthermore, we mutated aspartate residues of the D-loops. The mutation of aspartate to alanine (D590A) in the canonical NBS2 resulted in complete loss of transport activity. In contrast, mutation of the analogous aspartate residue (D1250A) in NBS1 only lowered the transport rate to about 50% of wild-type. We also interchanged the catalytic glutamate between two NBSs. The ensuing M584E/E1244Q double mutant showed about 15% residual transport activity as compared to wild-type protein. Kinetic modelling of the experimental data showed that the M584E/E1244Q double mutant was devoid of active transport characteristics and behaved as an ATP-gated facilitator. To the best of our knowledge this finding is unprecedented in ABC proteins with asymmetric NBSs.

Finally, we evaluated the inhibitory potential of the drugs that were predicted to be BSEP inhibitors by an in silico model, which was based on physiochemical properties of the compounds. Seven top scoring drugs were selected for experimental assessment of BSEP inhibition. The results indicated that bromocriptin significantly reduced the taurocholate transport as compared to DMSO control.

In conclusion, the current piece of work will be a step further in understanding the molecular mechanism of taurocholate transport by BSEP. Furthermore, it sets a platform for investigation of the substrate binding site as well as identification of the residues which are critical for interaction of drugs with the transporter.