Titelaufnahme

Titel
Exploring tumor biomarkers of pediatric brain tumors / submitted by Daniel Senfter, MSc.
Verfasser / VerfasserinSenfter, Daniel
GutachterSaydam, Okay
ErschienenWien, 05/2017
UmfangXVI, 114 Seiten : Illustrationen
HochschulschriftMedizinische Universität Wien, Dissertation, 2017
Anmerkung
Zusammenfassung in deutscher Sprache
Datum der AbgabeMai 2017
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Medulloblastom / Extrazelluläre Vesikel / OTX2 / MCM10
Schlagwörter (EN)Medulloblastoma / Extracellular vesicles / OTX2 / MCM10
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-10873 Persistent Identifier (URN)
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Zusammenfassung (Deutsch)

Teil I: Serum Tumor Biomarker für Medulloblastome

Das Medulloblastom (MB) ist einer der häufigsten und bösartigsten Hirntumore bei Kindern. Durch eine Entwicklung von nicht invasiven Methoden zur Früherkennung dieses Tumors könnten viele Leben der betroffenen Kinder verbessert werden. Demnach würde die Identifizierung von zirkulierenden Tumor-Biomarkern das Screening und den Nachweis des Tumors, die Überwachung des Fortschreitens der Krankheit und die Vorhersage der Prognose für das Überleben nach klinischer Intervention erleichtern. Der Transkriptionsfaktor OTX2 ist im adulten Hirn nicht exprimiert, aber in der Mehrheit von 60-75 % aller Patienten ist dieser überexprimiert. Für diese Studie stellen wir folgende Hypothese auf, dass OTX2 mRNA in extrazelluläre Vesikel (EV) verpackt wird und als nicht invasiver, zur Früherkennung oder als prognostischer Marker dienen kann. Um diese Hypothese zu verifizieren, wurden EVs aus Patientenserum isoliert und mittels qRT-PCR nach OTX2 mRNA analysiert. Mit Hilfe unserer Kohorte haben wir festgestellt, dass die mRNA Expression von OTX2 bei MB-Patienten (n = 9) im Serum signifikant höher war (im Durchschnitt 8-fach höher) als im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen. Diese Patienten wurden regelmäßig kontrolliert (zwischen neun Monaten und zwei Jahren), um den Verlauf der Krankheit zu überwachen. Bei sieben von neun Patienten sank das OTX2 mRNA Level auf jenes der Kontrollgruppe. Patienten, die in Remission waren oder Metastasen / eine inkomplette Tumorresektion aufwiesen, bildeten die Ausnahme. Diese Studien zeigten, dass OTX2 mRNA als prognostischer Marker zur Überwachung der Behandlung dienen könnte. Diese Studie identifiziert OTX2 als den ersten genetischen Tumor Biomarker in EV aus Serum von MB-Patienten.

Teil II: Tumor Gewebsbiomarker für Medulloblastome

Der pre-Replikations-Komplex (Pre-RC) ist ein Multiprotein-Komplex und spielt eine Schlüsselrolle bei der Anordnung und Initiierung der eukaryotischen DNA-Replikation. Die Überexpression von mehreren pre-RC-Elementen wurde in verschiedenen Tumorarten, einschließlich des Medulloblastoms (MB), identifiziert. Die Überexpression von 2, 3 und 7 der Minichromosom (MCM) Proteinen ist mit Migration und Invasion in MB assoziiert. In dieser Studie zeigen wir ein umfassendes mRNA-Expressionsprofil von einem größeren Satz von pre-RC-Elementen in verschiedenen MB-Zelllinien und Tumorgeweben. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die pre-RC-Elemente in der Mehrzahl der MB-Zelllinien und Tumorgewebe signifikant überexprimiert sind. Das Minichromosom-Maintenance-Protein 10 (MCM10) wies die höchste Überexpression ( 500-1000-fach) unter allen pre-RC-Elementen auf. Durch siRNA vermittele Reduktion der MCM10 Expression wurde die Viabilität und die Proliferationsrate in MB Zellen signifikant reduziert. Unsere Studie liefert Hinweise für eine Deregulierung von pre-RC-Elementen in MB und deutet darauf hin, dass MCM10 ein potentielles therapeutisches Ziel für MB sein kann.

Teil III: Inhibierung von Glioblastom Tumor Wachstum in vivo durch EV mediierten Suizid mRNA/Protein Transfer.

Extrazelluläre Vesikel (EVs) werden als wichtige Mediatoren der interzellulären Kommunikation betrachtet, die ein vielfältiges Repertoire an genetischen Informationen zwischen den Zellen transferieren. Diese Eigenschaft von EVs kann verwendet werden, um ihr therapeutisches Potential voranzutreiben. Wir haben zuvor gezeigt, dass genetisch manipulierte EVs, die das Suizid-Gen Cytosin-Deaminase (CD) fusioniert mit Uracil-Phosphoribosyltransferase (UPRT) in sich tragen, das Wachstum von Schwannom Tumoren in vivo inhibieren. Um zu untersuchen, ob dieser Ansatz auch bei anderen Tumoren angewendet werden kann, haben wir ein subkutanes Xenograft-Glioblastom-Tumormodell bei Mäusen etabliert. Das Glioblastom ist der häufigste primäre Hirntumor und gegenüber dem ursprünglichen Schwannomtumormodell um einiges aggressiver. In die Flanken von nackten SCID-Mäusen wurden U87-MG Zellen implantiert und anschließend EVs intratumoral injiziert, welche aus den Zellen, die EGFP oder CD-UPRT exprimierten, isoliert wurden. Nach der intraperitonealen Verabreichung der Prodrug 5-Fluorcytosin wurde das Tumorwachstum durch regelmäßige Messungen dokumentiert. Unsere Daten veranschaulichen, dass die Behandlung mit den CD-UPRT-angereicherten EVs zu deutlich reduziertem Tumorwachstum bei Mäusen führte. Unsere Ergebnisse zeigen, dass EVs die mit therapeutischer CD-UPRT-mRNA / Protein beladen wurden, ein nützliches Werkzeug für die Glioblastom Behandlung sein könnte.

Zusammenfassung (Englisch)

Part I: Serum tumor biomarker for Medulloblastomas

Medulloblastoma (MB) is one of the most malignant and frequent childhood brain tumors. Development of a non-invasive assay to detect MB in early stages might improve the life of many children. Accordingly, identification of circulating tumor biomarkers in MB patients would facilitate screening and detecting the cancer, monitoring the progression of the disease, and predicting the prognosis for survival after clinical intervention. The transcription factor OTX2, which is normally silenced in the adult brain, is overexpressed in the majority of MBs (60-75%). In this study, we hypothesized that OTX2 mRNA encapsulated in extracellular vesicles (EVs) can serve as a non-invasive, early diagnostic and/or prognostic biomarker for MB. Therefore, we performed qRT-PCRs for the OTX2 mRNA isolated from patients EVs. In our discovery cohort, we determined that serum OTX2 mRNA expression was significantly higher (8-fold higher on average) in MB patients (n=9) compared to healthy control subjects. We followed these patients from nine months to two years to monitor their status of disease. From seven of our patients the postoperative OTX2 mRNA levels decreased significantly to control levels, except the patients who showed remission or metastasis/incomplete tumor resection. These studies showed that OTX2 mRNA could serve as a prognostic marker to monitor the treatment regimes. Taken together, this study identifies OTX2 as the first genetic tumor biomarker in the serum EVs of MB patients.

Part II: Tumor Tissue biomarker studies for Medulloblastomas

Pre-replication complex (pre-RC) is a multiprotein complex that plays a key role in orchestrating the initiation of eukaryotic DNA replication. Overexpression of several pre-RC elements have been identified in different cancer types, including medulloblastoma (MB). Notably, overexpression of minichromosome maintenance (MCM) proteins 2, 3 and 7 is associated with migration and invasion in MB. In this study, we provide a more comprehensive mRNA expression profiling of a larger set of pre-RC elements in different MB cell lines and tumor tissues. Our results show that pre-RC elements are significantly overexpressed in the majority of MB cell lines and tumor tissues. Notably, minichromosome maintenance protein 10 (MCM10) shows the highest level of overexpression (500-1000-fold) among all pre-RC mRNAs. In addition, siRNA-mediated silencing of MCM10 reduces cell viability, cell number and cell proliferation in MB cells. Taken together, our study provides evidence for deregulation of pre-RC elements in MB, and suggests that MCM10 is a potential therapeutic target for MB.

Part III: Extracellular vesicle-mediated suicide mRNA/protein delivery inhibits glioblastoma tumor growth in vivo

As important mediators of intercellular communication, extracellular vesicles (EVs) are known to transfer all kind of genetic information between cells, which make them ideal candidates to improve and advance therapeutic potential. In a schwannoma tumor model, we demonstrated that genetically engineered EVs containing a suicide gene mRNA and protein-cytosine deaminase (CD) which is fused to uracil phosphoribosyltransferase (UPRT) reduced tumor growth in vivo. Glioblastoma is the most common primary brain tumor and highly aggressive with limited treatment options. Therefore, we established a subcutaneous glioblastoma tumor model in mice to investigate if our approach can be used here as well. We implanted U87-MG cells into flanks of SCID mice followed by intratumoral injection with EVs, isolated either from cells expressing CD-UPRT or EGFP. Tumor growth was determined by caliper measurements after intraperitoneal administration of the prodrug 5-fluorocytosine. Here we showed a significantly reduced tumor growth in vivo after treatment with CDUPRT-enriched EVs. Taken together, our findings may be a useful tool for the treatment of glioblastoma with EVs carrying CD-UPRT mRNA/protein.