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Title
Effects of matrix metalloproteinase cleavage of osteopontin on human adipocyte function and their blockade with a monoclonal antibody / submitted by Lukas Leitner
AuthorLeitner, Lukas
CensorStulnig, Thomas
Published2015
Description114 Bl. : Ill.
Institutional NoteWien, Med. Univ., Diss., 2015
LanguageEnglish
Bibl. ReferenceOeBB
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)Osteopontin / Matrix-Metalloprotease / Adipozyt / Entzündung / Diabetes
Keywords (EN)osteopontin / matrix metalloproteinase / adipocyte / inflammation / diabetes
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-10911 Persistent Identifier (URN)
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Effects of matrix metalloproteinase cleavage of osteopontin on human adipocyte function and their blockade with a monoclonal antibody [4.45 mb]
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Abstract (German)

Hintergrund/Ziele. Adipositas induzierte Fettgewebsentzündung führt zu Adipozyten-Dysfunktion und Insulinresistenz aber wurde auch mit malignen Prozessen in Verbindung gebracht. Osteopontin (OPN), ein entzündliches Zytokin, welches mit vielen pathologischen und malignen Prozessen korreliert, ist auch im Fettgewebe bei Adipositas vermehrt vorhanden und beeinflusst die Adipozyten direkt über Entzündung und folglich Insulinresistenz. Entzündung erhöht Aromatase-Expression und folglich auch Östrogenproduktion in humanen Adipozyten, was eine mögliche Erklärung für den Zusammenhang zwischen Adipositas und der erhöhten Rate an hormonabhängigem postmenopausalem Brust- und Endometrium-Krebs darstellen könnte. Die diesbezügliche Rolle von OPN wurde noch nicht untersucht. Basierend auf der Erkenntnis, dass sich OPN-Aktivität durch Verdau mit Matrix-Metalloproteasen (MMP) erhöht, war es Ziel dieser Studie, mögliche Korrelationen zwischen OPN, MMP und Aromatase zu untersuchen und das Vorhandensein von OPN-Spaltprodukten im Fettgewebe zu untersuchen. Der Bindungsmechanismus von OPN und Spaltprodukten an humanen Adipozyten in-vitro, Einfluss auf ihre Gen-Expression und Funktion und ob diese Effekte mit einem monoklonalen Antikörper blockierbar sind, wurde in dieser Studie untersucht. Material/Methoden. Fettgewebe von schlanken und adipösen Spendern wurde hinsichtlich Gen-Expression von OPN und MMPs und Fettgewebe via Western blot und Immunohistochemie auf MMP-gespaltenes OPN (MMP-cOPN) untersucht. Humane Spender-Adipozyten wurden in-vitro mit rekombinantem OPN und MMP-cOPN stimuliert. Inflammatorische Zellaktivierung, Gen-Expression, Insulin-stimulierte Signalübertragung und Glukoseaufnahme wurden analysiert. Ein monoklonaler Antikörper, gegen die freie MMP-Spaltstelle von OPN gerichtet, wurde zur Blockade der gefundenen Effekte verwendet. Die Östrogenproduktion der Adipozyten wurde mit ELISA gemessen und seine Aktivität mithilfe indirekter Ko-Kultur von MCF-7 Zellen untersucht. Ergebnisse. OPN Expression war im humanen Fettgewebe stark mit MMP-9, selbst in der Lage OPN zu spalten, und in viszeralem Fettgewebe mit Aromatase korreliert. Aromatase Expression korrelierte wiederrum mit MMP-2, -7 und -9 im viszeralen und MMP-2 und -9 im subkutanen Fettgewebe. Weiters konnten wir im Fettgewebe von Adipösen vermehrtes cOPN sowie das Epitop unseres monoklonalen Antikörpers feststellen. Stimulation von Adipozyten mit OPN führte zu vermehrter Phosphorylierung von p38 und ERK und erhöhte die Expression von MMP-9 und CCL-5, während Adiponektin, GLUT-4 und PPARg Expression sanken, was zu einer verminderten Insulin-stimulierten Glukoseaufnahme führte. Aromatase Gen und Protein Expression waren nach OPN Stimulation ebenfalls erhöht. MMP-cOPN führte zu einer Steigerung der Effekte. Der Antikörper gegen die OPN-eigene MMP-Schnittstelle verminderte selektiv die MMP-cOPN-Effekte auf Adipozyten. Östradiol Produktion, welche durch OPN und MMP-cOPN Stimulation in Adipozyten erhöht wurde, führte zu signifikant erhöhter MCF-7 Zellproliferation, welche unter Kontroll-Behandlung mit TNFa nicht gefunden wurde. Schlussfolgerung. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass MMP-cOPN, welches bei Adipositas vermehrt im Fettgewebe vorhanden ist, zu entzündlicher, pro-diabetischer Veränderung in Adipozyten führt, aber auch andere Aspekt der Adipozyten-Entzündung, wie die Östradiol Produktion beeinflusst, welche mit vermehrter Bildung postmenopausaler hormonabhängiger Krebsformen bei Adipositas in Verbindung gebracht wird. Selektive Antikörper-Blockade dieses Effektes eröffnet Möglichkeiten für eine immuno-therapeutische Behandlung der Adipositas induzierten Insulin-Resistenz sowie ihrer Konsequenzen.

Abstract (English)

Background/Aims. Obesity-driven adipose tissue (AT) inflammation results in adipocyte dysfunction and insulin resistance but has also been linked to malignant processes. Osteopontin (OPN) is an inflammatory cytokine correlated to several pathologic and malignant processes, also upregulated in AT in obesity where it directly affects adipocyte function by inducing inflammatory signaling and decreased insulin sensitivity. Inflammation increases aromatase expression and consequently estradiol production in human adipocytes, offering a possible explanation for the correlation between obesity and increased postmenopausal hormone dependent breast and endometrium cancer. The role of OPN in this aspect of adipocyte inflammation is still unknown. Based on the fact that OPN's activity is amplified by matrix-metalloproteinase (MMP) cleavage, this study aimed at investigating the correlation between OPN, MMPs and aromatase expression and presence of OPN cleavage products in human AT in obesity. Binding of OPN and its cleavage products to human adipocytes in-vitro, impact on their gene expression and function, and whether such effects can be blocked by means of a monoclonal antibody, were investigated within this study. Materials/Methods. AT from lean and obese donors was analyzed for gene expression of OPN and MMPs and OPN fragments in AT were determined by Western blot and immunohistochemistry. Primary human in-vitro differentiated adipocytes were stimulated with human recombinant OPN or OPN cleaved with MMP-7 (MMP-cOPN). Inflammatory signaling, gene and protein expression, insulin-stimulated signaling and glucose uptake, and integrin-receptor blockade of the effects were analyzed. A monoclonal antibody directed against the free MMP-cleavage site of OPN was used for blockade of MMP-cOPN. Furthermore, adipocyte estradiol production was measured by ELISA and its activity assessed by MCF-7 cell proliferation in indirect co-culture. Results. In human obesity, OPN gene expression was highly correlated with MMP-9, known to be capable of OPN cleavage, and aromatase expression in visceral AT. Aromatase expression was correlated with MMP-2, -7 and -9 in visceral and MMP-2 and -9 in subcutaneous AT. Moreover, we could detect increased levels of OPN cleavage products in AT of obese compared to lean as well as the epitope of a MMP-cleavage site-specific monoclonal antibody in AT of obese. Stimulating adipocytes with OPN resulted in phosphorylation of p38 and ERK and increased expression of MMP-9 and CCL-5 while adiponectin, GLUT-4 and PPARg expression was decreased, resulting in decreased insulin stimulated glucose uptake. Aromatase gene and protein expression were also increased by OPN stimulation. These effects were enhanced by MMP cleavage of OPN. The monoclonal antibody, directed against the free MMP-cleavage site of OPN significantly blocked inflammatory effects of MMP-cleaved OPN on adipocytes. Estradiol production, induced by OPN and MMP-cOPN in adipocytes, led to significantly increased MCF-7 cell proliferation, not found after control treatment with TNFa. Conclusions. Our findings show, that action of MMP-cOPN, increasingly present in adipose tissue in obesity, results in an inflammatory, pro-diabetic response in adipocytes, but also affects other aspects of adipocyte inflammation like estradiol production, linked to increased development of hormone sensitive postmenopausal cancers in obesity. Specifically targeting these effects opens new avenues for immunotherapeutic treatment of obesity-induced adipocyte inflammation and its consequences.