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Bibliographic Metadata

Title
Cell culture models to study endothelial activation under septic conditions / submitted by Tanja Eichhorn
Additional Titles
Zellkulturmodelle zur Untersuchung der endothelialen Aktivierung unter septischen Bedingungen
AuthorEichhorn, Tanja
Thesis advisorWeber, Viktoria
PublishedWien, 2017
Descriptionxvii, 111 Blätter : Illustrationen
Institutional NoteMedizinische Universität Wien, Dissertation, 2017
Annotation
Zusammenfassung in deutscher Sprache
Date of SubmissionMay 2017
LanguageEnglish
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)Zellkulturmodelle / Endothel / Extrakorporale Therapien / Lipopolysaccharid / Monozytenadhäsion / Mikrovesikel / Sepsis
Keywords (EN)cell culture models / endothelium / extracorporeal therapies / lipopolysaccharide / monocyte adhesion / microvesicles / sepsis
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-12508 Persistent Identifier (URN)
Restriction-Information
 The work is publicly available
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Cell culture models to study endothelial activation under septic conditions [9.37 mb]
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Abstract (German)

Sepsis ist ein lebensbedrohliches Syndrom, das durch eine fehlangepasste Immunantwort auf eindringende Krankheitserreger entsteht. Im Laufe der Sepsis entwickelt sich die Wirtsreaktion zu einem stark deregulierten Entzündungsprozess. Insbesondere das Endothel nimmt eine zentrale Rolle in der Pathophysiologie der Sepsis ein und seine massive Aktivierung als Reaktion auf systemische Entzündungen trägt wesentlich zu mikrozirkulatorischen Veränderungen, Organversagen und Tod bei.

Das primäre Ziel dieser Arbeit war es, Zellkulturmodelle zu entwickeln um die endotheliale Aktivierung unter septischen Bedingungen zu untersuchen, sowohl im statischen Modell als auch unter Flussbedingungen. Endothelzellen wurden mit konditioniertem Medium von Lipopolysaccharid (LPS)-stimulierten monozytären Zellen oder von LPS-stimuliertem Vollblut behandelt.^ ^Die Inkubation von Endothelzellen mit diesen konditionierten Medien führte zu einer verstärkten Aktivierung, die durch die erhöhte Sekretion von Entzündungsmediatoren, die Freisetzung des antifibrinolytischen Faktors Plasminogenaktivatorinhibitor (PAI)-1, die hochregulierte Expression von Zelladhäsionsmolekülen und die verstärkte Adhäsion von monozytären Zellen an das Endothel nachgewiesen wurde.

Neben der endothelialen Aktivierung als Reaktion auf konditioniertes Medium von LPS-stimulierten monozytären Zellen oder LPS-stimuliertem Vollblut wurde die Wirkung von septischem Blut auf die Aktivierung der Endothelzellen im Flussmodell untersucht. Plasmaproben von 30 Patienten mit Nierenversagen im Verlauf der Sepsis wurden mit einem Entzündungs-Array analysiert und zeigten eine ausgeprägte Heterogenität, die sich durch eine breite Konzentrationsspanne von Entzündungsmediatoren auszeichnete.^ Darüber hinaus wurde im Flussmodell festgestellt, dass Plasmen von verschiedenen Sepsis-Patienten wesentliche Unterschiede im Hinblick auf die Induktion der endothelialen Aktivierung und der Monozytenadhäsion aufweisen.

Filter- oder Adsorber-basierende extrakorporale Therapien stellen eine unterstützende Behandlungsmöglichkeit bei systemischer Entzündung dar, mit dem Ziel die immunologische Homöostase durch die Entfernung von Entzündungsmediatoren aus der Blutzirkulation zu verbessern oder wiederherzustellen. Daher wurden die in dieser Arbeit etablierten Zellkulturmodelle angewendet um den Einfluss der adsorptiven Immunmodulation auf die endotheliale Aktivierung zu untersuchen. Poröse Polystyrol-Divinylbenzol-basierende Adsorber sind in der Lage eine breite Palette an Entzündungsmediatoren aufgrund von hydrophoben Wechselwirkungen zu binden.^ Im Vergleich zu einem anti-TNF- Adsorber erwiesen sich poröse Polystyrol-Divinylbenzol-basierende Polymere in der Reduzierung der Endothelaktivierung effizienter, sowohl unter statischen Bedingungen als auch unter Fluss.

Die in dieser Arbeit entwickelten experimentellen Modelle können auch für die Beurteilung der Blutverträglichkeit von Adsorberpolymeren oder anderen Biomaterialien herangezogen werden. Als Beispiel wurden Polyacrylamid-basierende Adsorber, die in der Lipidapherese angewendet werden, als blutverträglich angesehen, da sie zu keiner endothelialen Aktivierung führten.^ Als zusätzlicher Indikator für die Blutverträglichkeit wurde die Adhäsion von Blutzellen an Adsorberpolymere sowie die Freisetzung und der zelluläre Ursprung von extrazellulären Vesikeln während des Kontakts von Vollblut mit Adsorberpolymeren untersucht.

Zusammenfassend sind die wichtigsten Ergebnisse dieser Arbeit:

(1) Die hier entwickelten Zellkulturmodelle stellen ein Werkzeug dar, um die endotheliale Aktivierung unter septischen Bedingungen zu untersuchen, die Wechselwirkung des aktivierten Endothels mit Immunzellen zu studieren und die Blutverträglichkeit von Adsorberpolymeren und anderen Biomaterialien zu beurteilen. (2) Monozytäre THP-1 Zellen und humane primäre Monozyten unterscheiden sich in deren Zytokinprofilen als Reaktion auf die Stimulation mit LPS. (3) Plasmaproben von Sepsis-Patienten zeigen eine hohe Heterogenität hinsichtlich der Konzentrationen von Entzündungsmediatoren und variieren in ihrem Potential das Endothel zu aktivieren.^ (4) Die endotheliale Aktivierung wurde durch das Entfernen einer breiten Palette an Entzündungsmediatoren stärker reduziert, als im Vergleich zur Entfernung einzelner Mediatoren. (5) Extrazelluläre Vesikel können als zusätzliche Biomarker dienen um die Zellaktivierung während extrakorporalen Therapien zu studieren. Die Wechselwirkung von extrazellulären Vesikeln mit Immunzellen in der Blutzirkulation und der mögliche Einfluss dieser Interaktion auf die Monozytenadhäsion an das (aktivierte) Endothel werden, unter Anwendung der hier entwickelten Zellkulturmodelle, Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.

Abstract (English)

Sepsis is a life-threatening syndrome arising from a maladaptive immune response to invading pathogens. In the course of sepsis, the host response develops into a highly deregulated inflammatory condition. The endothelium, in particular, occupies a central role in the pathophysiology of sepsis, and its massive activation in response to systemic inflammation significantly contributes to microcirculatory alteration, organ failure, and death.

The primary aim of this thesis was to develop endothelial cell culture models to study endothelial activation under septic conditions, both in a static set-up and under flow. Endothelial cells were stimulated with conditioned medium from lipopolysaccharide (LPS)-treated monocytic cells or from LPS-stimulated whole blood.^ ^Incubation of endothelial cells with these conditioned media resulted in their enhanced activation, as indicated by the increased secretion of inflammatory mediators, by the release of the antifibrinolytic factor plasminogen activator inhibitor (PAI)-1, by the upregulated expression of cell adhesion molecules, as well as by the enhanced adhesion of monocytic cells to the endothelial monolayer.

In addition to studying endothelial activation in response to conditioned medium from LPS-stimulated monocytic cells or from LPS-stimulated whole blood, the effect of septic blood on endothelial activation was assessed in the flow model. Plasma samples from 30 patients with renal failure in the course of sepsis were analyzed with an inflammation bead array, revealing pronounced heterogeneity with respect to inflammatory mediator concentrations.^ Plasma from different patients differed largely with respect to their potential to induce endothelial activation and monocyte adhesion in the flow model.

Filter- or adsorbent-based extracorporeal therapies may represent supportive treatment options in systemic inflammation, with the aim of improving or restoring the immunological homeostasis by the depletion of excess inflammatory mediators from the circulation. Therefore, the cell culture models established in this thesis were applied to study the influence of adsorptive immunomodulation on endothelial activation.^ Porous polystyrene-divinylbenzene based adsorbents, capable of binding a broad range of inflammatory mediators based on hydrophobic interactions, were found to be more efficient at reducing endothelial activation as compared to a specific anti-TNF- adsorbent, both in the static and in the flow model.

The models developed in this thesis may also be supportive in evaluating the hemocompatibility of adsorbent polymers or other biomaterials. As an example, polyacrylamide-based adsorbents for lipid apheresis were found to be blood compatible and did not result in endothelial activation in the static model.^ As an additional indicator of hemocompatibility, the adhesion of blood cells to the adsorbents as well as the release and cellular origin of extracellular vesicles was studied upon the contact of whole blood with adsorbent polymers.

In summary, the main findings of this thesis are:

(1) The cell culture models developed here provide a tool to study endothelial activation under septic conditions, to monitor the interaction of the activated endothelium with immune cells, and to assess the blood compatibility of adsorbent polymers and other biomaterials. (2) Monocytic THP-1 cells and human primary monocytes differ with respect to their cytokine profiles in response to LPS-stimulation. (3) Plasma samples from sepsis patients reveal considerable heterogeneity with respect to inflammatory mediator concentrations and vary in their potential to induce endothelial activation.^ (4) Broad spectrum depletion of cytokines is more efficient in reducing endothelial activation as compared to the removal of single mediators and (5) extracellular vesicles may serve as additional biomarkers of cellular activation during extracorporeal therapies. The interaction of extracellular vesicles with immune cells in the blood circulation and the potential influence of this interaction on monocyte adhesion to the (activated) endothelium will be the subject of further studies using the cell culture models developed in this thesis.

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