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Bibliographic Metadata

Title
Trafficking, folding and pharmacological rescue of dopamine transporter mutants linked with infantile parkinsonism-dystonia / submitted by Hafiz Muhammad Mazhar Asjad
Additional Titles
Transit, Falten und pharmakologische Rettung von Dopamin-Transporter-Mutanten verbunden mit infantiler Parkinsonismus-Dystonie
AuthorAsjad, Hafiz Muhammad Mazhar
Thesis advisorFreissmuth, Michael ; Sucic, Sonja
PublishedWien, 08/2017
DescriptionXII, 88 Seiten : Illustrationen
Institutional NoteMedizinische Universität Wien, Dissertation, 2017
Annotation
Zusammenfassung in deutscher Sprache
Date of SubmissionAugust 2017
LanguageEnglish
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)Dopamintransporter / Punktmutationen / infantilen/juvenilen Dystonie mit Parkinsonismus / Pharmakochaperon / Exozyst
Keywords (EN)Dopamine transporter / mutants / infantile/juvenile dystonia-parkinsonism / pharmacochaperoning / exocys
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-12131 Persistent Identifier (URN)
Restriction-Information
 The work is publicly available
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Trafficking, folding and pharmacological rescue of dopamine transporter mutants linked with infantile parkinsonism-dystonia [5.84 mb]
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Abstract (German)

Der Dopamintransporter (DAT) entfernt freigesetztes Dopamin aus dem synaptischen Spalt. DAT ist der Angriffspunkt von therapeutisch relevanten and illegalen Wirkstoffen, deren antriebsteigernde und euphorisierende Effekte als belohnend empfunden werden. Punktmutationen im Gene, das den humanen Dopamintransporter (hDAT, SLC6A3) codiert, führen zu einem Syndrom einer infantilen/juvenilen Dystonie mit Parkinsonismus. In der vorliegenden Arbeit wurden 13 krankheitsauslösende DAT-Mutanten untersucht: Nach heterologer Expression in HEK293 Zellen wurden diese im endoplasmatichen Retikulum (ER) retiniert. Bei drei DAT-Mutanten - hDAT-V158F, hDAT-G327R und hDAT-L368Q - wurde der Faltungsdefekt durch das Pharmakochaperon Noribogain oder durch Pifithrin-, einen Inhibitor des Hitzeschockproteins 70 (HSP70) korrigiert, sodass deren ER Export ermöglicht wurde und damit die Bindung eines Radioliganden an und die Substrataufnahme durch diese DAT-Mutanten restituiert wurde.^ ^Bei Drosophila melanogaster führt eine DAT-Defizienz zu einer reduzierten Schlafdauer. Die zellspezifische Expression von transgenen hDAT-Mutanten in Drosophila erlaubte es zu prüfen, ob eine pharmakologisch induzierte Wiederherstellung der Funktion sich auch in einem intakten Organismus beobachten ließ. Bei DAT-defizienten (fumin) Fliegen, die hDAT-V158F oder hDAT-G327R exprimierten, führte die Administration von Noribogain oder Pifithrin- zur Anlieferung der Transporter in die Axone und an die präsynaptischen Terminalen der dopaminergen Neurone, woraus eine Normalisierung der Schlafdauer resultierte. Die Expression von hDAT-L368Q war hingegen mit einer Letalität während der Entwicklung verbunden. Diese Beobachtung weist auf einen toxischen Effekte hin, der durch ein Pharmakochaperon nicht beseitigt werden kann.^ Mit dieser Arbeit wurden daher diejenigen Mutationen identifiziert, die mit großer Wahrscheinlichkeit auch bei den betroffenen Kindern durch Pharmakotherapie korrigiert werden können. Die Befunde illustrieren auch die Herausforderungen, die mit der Translation von Zellkulturexperimenten zur klinischen Anwendung von Pharmakochaperonen verbunden sind. Auf Grund der evolutionären Konservierung der dopaminergen Neurotransmission zwischen Drosophila and Menschen, kann diese Hürde durch Untersuchungen von Pharmakochaperonen von DAT bei Drosophila melanogaster möglicherweise leichter überwunden werden. Eine weitere Hypothese, die hier geprüft wurde, postulierte, dass DAT auf den Exozyst-Komplex angewiesen ist, um die Zelloberfläche zu erreichen. Ich identifizierte drei Komponenten des Exozyst-Komplex, nämlich SEC6, SEC8, and Exo70, die jeweils die Anlieferung von DAT aber nicht des nahe verwandten Serotonintransporters (SERT) an die Zelloberfläche kontrollierten.^ Nach pharmakologischer Korrektur des Faltungsdefektes durch Noribogaine oder Pifithrin- traf das auch für die hDAT-V158F zu. Diese Ergebnisse legen nahe, dass (i) einige Komponenten des Exozystkomplexes von DAT nach abgeschlossener Faltung aber vor dem ER-Export rekrutiert werden and (ii) dass nahe verwandte Transporter sich deutlich in ihren Protein-Protein Interaktionen unterscheiden, die ihren Transit durch den secretorischen Weg steuern.

Abstract (English)

The dopamine transporter (DAT) is responsible for sequestering released dopamine from the synaptic cleft. DAT is a target of therapeutically relevant and illicit recreational drugs. Point mutations in the gene encoding the human dopamine transporter (hDAT, SLC6A3) lead to a syndrome of infantile/juvenile dystonia and parkinsonism. We examined 13 disease-causing DAT mutants, which were retained in the endoplasmic reticulum (ER) when heterologously expressed in HEK293 cells. In three of these DAT mutants - i.e. hDAT-V158F, hDAT-G327R, and hDAT-L368Q the folding deficit was remedied by the pharmacochaperone noribogaine or the heat shock protein 70 (HSP70)-inhibitor pifithrin- such that ER export of and radioligand binding and substrate uptake by these DAT mutants were restored. In Drosophila melanogaster, DAT deficiency results in reduced sleep.^ ^We exploited the power of targeted transgene expression of mutant hDAT in Drosophila to explore, if the pharmacological rescue was also effective in an intact organism. Noribogaine or pifithrin- treatment restored sleep to normal length in DAT deficient (fumin) Drosophila lines, which expressed hDAT-V158F or hDAT-G327R, by supporting the delivery of the transporter to the presynaptic terminals of dopaminergic neurons. In contrast, expression of hDAT-L368Q in the DAT-deficient background lead to developmental lethality, indicative of a toxic action, which was not remedied by pharmacochaperoning. Our observations identify those mutations, which are most likely amenable to pharmacological rescue in the affected children. In addition, our findings also highlight the challenges in translating insights from pharmacochaperoning in cell culture to the clinical situation.^ Because of the evolutionary conservation in dopaminergic neurotransmission between Drosophila and people, pharmacochaperoning of DAT in Drosophila melanogaster may allow to bridge that gap. I also examined the hypothesis that DAT relied on the exocyst complex to reach the cell surface. I identified three components of the exocyst complex, namely SEC6, SEC8, and Exo70, which individually controlled trafficking of DAT but not of the closely related serotonin transporter (SERT). The same was examined for the mutants linked with infantile/juvenile dystonia and parkinsonism, after pharmacological rescue with noribogaine and pifithrin-. These findings indicate that (i) some exocyst components are recruited by DAT after folding is completed and prior to ER-export and (ii) that closely related transporters can differ substantially in the protein-protein interactions required to support their trafficking through the secretory pathway.

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