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Bibliographic Metadata

Title
Protein folding and ER-export of neurotransmitter transporters in Drosophila melanogaster / submitted by Ameya Sanya Kasture
Additional Titles
Proteinfaltung und ER-Export von Neurotransmittertransporter in Drosophila melanogaster
AuthorKasture, Ameya Sanjay
Thesis advisorFreissmuth, Michael
Published2017
Descriptionxiii, 88 Seiten
Institutional NoteMedizinische Universität Wien, Diss., 2017
Date of SubmissionAugust 2017
LanguageEnglish
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)Monoamintransporter, / Drosophila / Dopamintransporters / Serotonintransporter
Keywords (EN)Monoamine transporters / Drosophila / dopamine transporter / serotonin transporter
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-12638 Persistent Identifier (URN)
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Protein folding and ER-export of neurotransmitter transporters in Drosophila melanogaster [7.07 mb]
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Abstract (German)

Neurotransmittertransporter dienen dazu, freigesetzte Neurotransmitter wieder in die präsynaptische Nervenendigungen zurückzuholen. Gemeinsam mit den vesikulären Monoamintransporter, die die Neurotransmitter in den Vesikeln konzentrieren, erhalten sie die synaptische Homöostase. Wie alle Membranproteine, werden Neurotransmittertransporter der SLC6 Genfamilie werden im endoplasmatischen Retikulum (ER) synthetisiert. Nach abgeschlossener Faltung, rekrutieren die Transporteroligomere die Komponenten der COPII-Maschinerie für den ER-Export, sie werden in der Folge im ER-Golgi intermediären Kompartiment (ERGIC) and im Golgi sortiert und zur Plasmamembran dirigiert. Vor dem ER-Export unterliegen die Transporter einer stringenten Qualitätskontrolle im ER, sodass nur die nativ gefalteten Transporter das ER verlassen können. Wenn eine Punktmutation die Proteinfaltung beeinträchtigt, bleiben die Transport im ER stecken.^ ^Mehrere Erkrankungen lassen sich auch Punktmutationen von SLC6 Transporten zurückführen. Die Proteinfaltung kann durch chemische und pharmakologische Manipulationen unterstützt werden. In der vorliegenden Dissertation wurde eine Mutante des Drosophila melanogaster Dopamintransporters (dDAT-G108Q) als konzeptioneller Beweis für eine Pharmakochaperon-basierte Therapie untersucht. Fliegen, die diese Mutation tragen, haben ein stark reduzierte Schlafdauer; der Phänotyp entspricht dem DAT-defizienter fumin (=japanisch für schlaflos) Fliegen.^ Die Experiemnte zeigten, dass (i) dDAT-G108Q und sein humanes Äquivalent hDAT-G140Q im ER retiniert wurden, (ii) die heterelogous exprimierten Proteine die Zelloberfläche erreichten, wenn die Zellen mit Noribogain, einem DAT-Hemer, und mit Pifithrin-, einem Inhibitor des Hitzeschockproteins-70 (HSP70) inkubiert wurden, (iii) in Fliegen, die transgen für hDAT-G140Q waren, das Protein auf das neuronale Soma beschränkt war, aber die präsynaptischen Endigung erreichte, wenn den Fliegen über ihr Futter Noribogain verabreicht wurde; (iv) die Behandlung mit Noribogain, Pifithrin- oder deren Kombination normalisierte die Schlafdauer von Fliegen mit dDAT-G108Q aber nicht bei DAT-defizienten fumin Fliegen. Zusätzlich wurde die Leistungsfähigkeit der Drosophila-Genetik genutzt, um das Schicksal von Transportern zu untersuchen, die nach abgeschlossener Faltung den COPII-Mantel nicht rekrutieren können.^ SEC24 ist die COPII- Komponente, die als Cargo-Rezeptor für Proteinklienten dient. Bei Säugern liegen vier SEC24 Isoformen vor, bei Drosophila zwei. Serotonintransporter (SERT) von Säugern rekrutiert SEC24C für seinen ER-export über ein konserviertes, C-terminales R607I608-Motif. Hier wurde das Schicksal von hSERT-R607A untersucht: (i) diese Mutante verlässt das ER unabhängig von SEC24C; (ii) der SEC24C-unabhängige Export führt zur Anreicherung des Proteins im somatodendritischen Kompartiment von Neuronen, die aus den serotonergen Raphe-Kernen gewonnen. (iii) In Fliegen mit der äquivalenten Mutation im Drosophila SERT (dSERT-R509A) ereicht das Protein nicht das axonale Kompartiment. Diese Befunde bestätigen, dass der SEC24-abhängige Export für die korrekte Verteilung von SERT notwendig ist. Sie legen auch einen experimentellen Zugang nahe, mit dem die biologische Rolle von SERT im somatodendritischen Kompartiment geprüft werden kann.

Abstract (English)

Neurotransmitter transporters retrieve the neurotransmitter from synaptic and extrasynaptic places and work in relay with vesicular monoamine transporters to maintain synaptic homeo-stasis. Neurotransmitter transporters belonging to SLC6 gene family begins their journey by folding in the endoplasmic reticulum (ER). Upon achieving the natively folded state the oligo-merized transporters recruit components of the COPII machinery for ER-export. The transporters are further sorted in the ER-Golgi intermediate compartment (ERGIC) and the Golgi, before reaching the plasma membrane. Before exiting the ER transporters undergo stringent ER quality control and only the natively folded protein exits the ER. In rare circum-stances where a point mutation affects the protein folding, transporters remain stalled in the ER. A number of diseases result from point mutations in the SLC6 family. Chemical and pharmacological means can be used can to assist protein folding.^ ^In the current thesis, a mutant of the Drosophila melanogaster dopamine transporter (dDAT-G108Q) was studied as a proof-of-concept. Flies carrying this mutation show a sleepless phenotype, similar to fumin (=DAT-deficient) flies. The present thesis showed that (i) - as a consequence of the mutation - dDAT-G108Q and its human counterpart hDAT-G140Q were retained in the ER; (ii) the heterelogously expressed proteins reached the cell surface, if the cells were incubated with noribogaine, an inhibitor of DAT, and pifithrin-, an inhibitor of heat shock protein-70 (HSP70); (iii) in flies harboring hDAT-G140Q, the protein was confined to the neuronal soma but was delivered to the presynaptic specializations, if the flies had been administered noribo-gaine via their food; (iv) similarly, treatment with noribigaine, pifithrin- or a combination of the two compounds restored sleep to flies harboring dDAT-G108Q but not to DAT-deficient fumin flies.^ In addition, I used the power of Drosophila genetics to study the fate of transpor-ters, which fail to recruit the COPII coat after they have reached the folded state. SEC24 is the COPII component, which acts as cargo receptor for client proteins. In mammals and Droso-phila, there are four and two SEC24 isoforms, respectively. Mammalian serotonin transpor-ters (SERT) specifically recruit SEC24C for ER-export via the conserved R607I608-motif in the C-terminus. In the current thesis, the fate of the SERT-R607A mutant was examined: (i) hSERT-R607A exits the ER in a manner independent of SEC24C; (ii) SEC24C-independent export results in enrichment of the protein in somatodendritic compartment of cultured raphe neurons. (iii) In flies, harboring the equivalent mutation in Drosophila SERT (dSERT-R509A), the protein does not enter the axonal compartment. These observations confirm that SEC24-dependent export is required for correct targeting of SERT.^ They also point to an approach to explore the biological role of SERT in the somatodendritic compartment.

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