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Bibliographic Metadata

Title
Establishment of a western blot protocol for the evaluation of CLOCK,CRY1,CRY2 and PER3 protein levels in dental pulp-derived cells
Additional Titles
Die Etablierung eines Western Blot Protokolls für die Evaluierung eines CLOCK,CRY1,CRY2 und PER3 Protein Levels in Zellen der Zahnpulpa
AuthorAlsafar, Marwa
Thesis advisorAgis, Hermann
Published2017
Description85 Blatt : Illustrationen
Institutional NoteMedizinische Universität Wien, Diplomarbeit, 2017
Annotation
Paralleltitel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Date of SubmissionDecember 2017
LanguageEnglish
Document typeThesis (Diplom)
Keywords (DE)die zirkadiane Uhr / die Clock genes CLOCK,CRY1,CRY2 und PER3 / die Pulpa stammenden Zellen / 2D-Monoschicht Kulturen / 3D-Sphäroid Kulturen / Hypoxie / L-Mimosine / NIR DYE-Scanner / ECL-Chemilumineszenz-Technik
Keywords (EN)circadian clock / Clock genes CLOCK,CRY1,CRY2 and PER3 / dental pulp-derived cells / 2D monolayer culture / 3D spheroid culture / Hypoxie / L-Mimosine / NIR DYE-Scanner / ECL-Chemilumineszenz method
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-12008 Persistent Identifier (URN)
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 The work is publicly available
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Establishment of a western blot protocol for the evaluation of CLOCK,CRY1,CRY2 and PER3 protein levels in dental pulp-derived cells [3.2 mb]
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Abstract (German)

Einleitung: Durch die zirkadiane Uhr, eine komplexe Molekulare Maschinerie, beeinflusst der zirkadiane Rhythmus das breite Spektrum der physiologischen Funktionen.

Die Expression und die potentielle Rolle der zirkadianen Uhr in der Zahnpulpa bleibt noch zu klären. Hinweise aus Genexpressionsstudien zeigen, dass die Zellen des oralen Gewebes, einschließlich die von Pulpa stammenden Zellen, die „Clock-genes“ CLOCK, CRY 1, CRY 2 und PER 3 auf der m RNA-Ebene produzieren. Sie können durch Hypoxie und L-Mimosine moduliert werden. Ob diese Regulation der m RNA-Ebene auf die Protein-Ebene übertragen wird, ist unklar. Ein mögliches Werkzeug zur Bewertung der Proteinspiegel ist der Western-Blot. Das Ziel dieser Studie ist die Etablierung eines Western-Blot-Protokolls zur Evaluierung von CLOCK, CRY 1, CRY 2 und PER 3 in Zellen der Zahnpulpa.

Methoden: Zellen der Zahnpulpa wurden in 2D-Monoschicht- und 3D-Sphäroid-Kulturen unter normoxischen Bedingungen sowie in Gegenwart von L-Mimosine oder Hypoxie kultiviert. Die Zellen wurden nach 24 Stunden lysiert. SDS-PAGE wurde durchgeführt und Protein wurden auf eine Membran übertragen. Anschließend wurden die Membranen gewaschen und über Nacht dem ersten spezifischen Antikörper für CLOCK, CRY1, CRY2 bzw. PER3 ausgesetzt. Danach wurden die Membranen nochmals gewaschen und mit den entsprechenden sekundären Antikörpern behandelt. Nach der letzten Waschung wurden die Membranen unter Verwendung von einem NIR DYE-Scanners als auch mittels ECL-Chemilumineszenz-Technik bewertet und durch Aufnahmen dokumentiert.

Resultate: In dieser Studie haben wir ein Protokoll für die Western Blot-Technik zum Nachweis von CLOCK, CRY1, CRY 2 und PER 3 erarbeitet. Wir konnten zeigen, dass CLOCK, CRY1, CRY 2 und PER 3 in den menschlichen Pulpazellen sowohl in 2D-Mono-als auch 3D-Sphäroid-Kulturen in vitro sowohl unter hypoxischen Bedingungen also auch in Gegenwart von L-Mimosine produziert werden.

Schlussfolgerung: Western-Blotting ist eine geeignete Methode zur Detektion von CLOCK, CRY 1, CRY 2 und PER 3 auf der Proteinebene in humanen Zellen der Zahnpulpa. Es lieferte ein semiquantitatives Ergebnis. Die Ergebnisse des ECL-basierten Nachweises ist der IRFarbstoff-basierten Methode zum Nachweis von CLOCK, CRY 1, CRY 2 und PER 36 überlegen, da die Proteinmengen unter dem Nachweisniveau für die NIR-basierte Methodik zu liegen scheinen. Die hier beschriebene Methode wird die Erforschung der Rolle der zirkadianen Uhr in der Pulpa unterstützen.

Abstract (English)

Introduction: The circadian rhythm remarkably influences a broad spectrum of physiological functions involving a complex molecular machinery termed the circadian clock. The expression and potential role of the circadian clock on dental pulp-derived cells (DPCs) remains to be elucidated, hints of gene expression studies show that the cells of the oral tissue including dental pulp-derived cells show that the clock genes CLOCK, CRY 1, CRY 2 and PER 3 are produced at the mRNA level and they can be modulated by hypoxia and L-Mimosine, and whether this regulation of the mRNA level is translated to the protein level is unclear, a potential tool to evaluate the protein levels is the western blotting. However, a protocol to evaluate the circadian clock components in DPC has not been established at the school of dentistry so far, therefore, the purpose of this study is to establish a western blot protocol for the evaluation of CLOCK, CRY 1, CRY 2, and PER 3 protein levels in DPC.

Methods: DPC were cultured in 2D monolayer and 3D spheroid cultures under normoxic conditions in the presence of L-Mimosine and under hypoxic conditions, cells were harvested after 24 hours, they were lysed, and protein collected. SDS-PAGE were performed, and samples of the protein lysate transmitted to the membrane, afterwards they were washed and exposed to the first antibodies specific for CLOCK, CRY1, CRY2 and PER3 overnight, washed, then subjected to the respective secondary antibody, last wash was performed, and the membranes were assessed using both NIR DYE scanner and an ECL chemiluminescencebased method and images were taken.

Results: In this study we established a protocol for the analysis of CLOCK, CRY 1, CRY 2 and PER 3 by western blot, that works with the ECL chemiluminescence detecting method, this tool facilitated the detection of the circadian clock expression proteins, we showed that CLOCK, CRY1, CRY 2 and PER 3 are produced in the human DPC cultured in both 2D monolayer and 3D spheroid cultures in vitro in the presence of L-Mimosine and hypoxia.

Conclusion: Western blotting is a feasible method for the detection of CLOCK, CRY 1, CRY 2 and PER 3 expressions at the protein level in DPC. It provided a semi-quantitative result. ECL based assessment was superior to the NIR Dye based assessment. The here presented method will support research on the circadian clock in the dental pulp.

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