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Titelaufnahme

Titel
Determination of conformational changes in the leucine transporter using luminescence resonance energy transfer (LRET) spectroscopy / submitted by Azmat Sohail
Weitere Titel
Determination of conformational changes in the leucine transporter using luminescence resonance energy transfer (LRET) spectroscopy
Verfasser / VerfasserinSohail, Azmat
GutachterSitte, Harald
Erschienen2017
Umfang62 Seiten : Illustrationen
HochschulschriftMedizinische Universität Wien, Diss., 2017
Datum der AbgabeAugust 2017
SpracheEnglisch
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (EN)Luminescence resonance
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-12823 Persistent Identifier (URN)
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Determination of conformational changes in the leucine transporter using luminescence resonance energy transfer (LRET) spectroscopy [9.02 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Die humanen Neurotransmitter-Transporter gehört zur Familie der “Solute Carrier” Nr. 6, die auf präsynaptischen Nervenendigungen sowie auf Gliazellen gefunden werden. Diese Transporter besitzen die Eigenschaft, synaptische Neurotransmission zu beendigen, indem sie die Wirkung von präsynaptisch durch Freisetzungsereignisse in den synaptischen Spalt gelangten Neurotransmitter Moleküle wiederaufnehmen. Zu diesen humanen Transportproteinen gibt es bakterielle Homologe, beispielsweise den Leucin-Transporter LeuT, der in verschiedenen unterschiedlichen Konformationen aus dem Archae-Bakterium Aquifex aeolicus kristallisiert werden konnte. Diese unterschiedlichen Konformationen umfassen eine außen-offene, außen-geschlossene und innen-offene Konformation.

In der vorliegenden Arbeit wurden die Konformationsänderungen von LeuT auf atomarer Ebene untersucht. Der primäre Fokus war es, die Änderungen der intramolekularen Distanzen zu bestimmen, die mit Bewegungen des Aminoterminus assoziiert sind. Zweitens sollte der Effekt untersucht werden, den die Membranumgebung, in die LeuT eingebettet ist, spielt, unter spezieller Berücksichtigung der Dynamik der Transmembran-Domäne 1a (TM1a). Zur Untersuchung der intramolekularen Distanzen auf atomarer Ebene wurde ein experimenteller Ansatz auf Basis der Lanthaniden-gestützten Resonanz-Energie-Transfer (LRET) Spektroskopie eingesetzt.

Wenn man die Daten der vorliegenden Studie mit der innen-offenen Kristallstruktur von LeuT genau betrachtet, so verbleiben die geladenen Aminosäuren der TM1a in Detergens-Mizellen relativ unbeweglich am selben Platz. Im Vergleich dazu zeigt die vorliegende Untersuchung, dass eine Bewegung von TM1a und hier insbesondere die Bewegung der geladenen Aminosäuren aus der Membranumgebung stattfindet, wenn LeuT in Membranen rekonstituiert wurde. Parallel dazu durchgeführte Molekulardynamik-Untersuchungen unterstützten die mit der LRET-Technik erhobenen Befunde, die einen klaren Unterschied zwischen Protein-Konformation in Detergens-Systemen und Membran-Rekonstitution zeigen.

Zusammenfassung (Englisch)

Human neurotransmitter transporters from the solute carrier family 6 of proteins are found on presynaptic neurons and on glial cells. These transporters inherently terminate synaptic signalling by rapid removal of neurotransmitter molecules from the synaptic cleft. The bacterial homolog transporter LeuT from Aquifex aeolicus was crystallized in various distinctive conformations, which include the outwardopen, outward-occluded and inward-open states. Here, the conformational changes in the architecture of LeuT were explored at the atomic level. The primary focus was to determine the changes in intramolecular distances associated with the N-terminus of LeuT. Secondly, the effect of the membrane environment was determined with respect to the dynamics of the transmembrane helix 1a (TM1a). The atomic scale conformational changes were experimentally addressed by employing a lanthanidebased resonance energy transfer (LRET) technique. According to the inward-open crystal structure of LeuT, the charged amino acids of TM1a in detergent micelles moved outwards unrestricted while maintaining a substrate-releasing conformation.

The present study revealed that although in detergent micelles the outward movement of TM1a was unrestricted, it was constrained in a membrane environment. Molecular dynamic simulations of LeuT in detergent micelles versus a membrane environment supported the intramolecular distances obtained with LRET.

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