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Bibliographic Metadata

Title
Mechanisms mediating response/resistance against triapine and its novel derivatives / submitted by Walter Miklos
Additional Titles
Response-/ Resistenzmechanismus gegen Triapin und seine neuartigen Derivate
AuthorMiklos, Walter
Thesis advisorBerger, Walter
Published2018
Description162 Seiten : Illustrationen
Institutional NoteMedizinische Universität Wien, Dissertation, 2018
Annotation
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Date of SubmissionJanuary 2018
LanguageEnglish
Bibl. ReferenceOeBB
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)Triapin / Resistenz / ABC-Transporter / ABCB1 / PKC / Epac / PDE4D
Keywords (EN)Triapine / Resistance / ABC-Transporter / ABCB1 / PKC / Epac / PDE4
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-16668 Persistent Identifier (URN)
Restriction-Information
 The work is publicly available
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Mechanisms mediating response/resistance against triapine and its novel derivatives [5.62 mb]
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Classification
Abstract (German)

Aufgrund der hohen Proliferationsrate von Krebszellen und dem damit verbundenen erhöhten Bedarf an Desoxyribonukleotiden wurden gezielte Chemotherapeutika entwickelt, welche die Ribonukleotidreduktase inhibieren. Die Ribonukleotidreduktase (RR) ist ein wichtiges Enzym, das an der Umwandlung von Ribonukleotiden in Desoxyribonukleotide beteiligt ist. Aufgrund dieses limitierenden Schrittes während der DNA de novo-Synthese stellt die RR ein geeignetes Ziel für die Behandlung von Krebs dar. Die zweite Untereinheit (R2) der RR enthält ein Eisenzentrum, welches einen Tyrosylradikal stabilisiert. Mit dem Ziel, dieser Stabilisierung des Tyrosylradikals im Eisenzentrum entgegenzuwirken, wurden in den letzten Jahrzehnten mehrere verschiedene Klassen von Eisenchelatoren entwickelt. Die vielversprechendsten Kandidaten gehören dabei zur Klasse der Thiosemicarbazone. Dies führte zur klinischen Erprobung von Triapin (3-Aminopyridin-2-carboxaldehyd-thiosemicarbazon), das in klinischer Phase-I- und II-Studien gegen fortgeschrittene Leukämie vielversprechende Aktivität zeigte. Im Gegensatz dazu wurde bei Patienten mit soliden Tumoren keine signifikante Verbesserung beobachtet (weder als Einzel- noch Kombinationstherapie). Die Gründe für die Unwirksamkeit dieses Chemotherapeutikums sind unbekannt. Eine Möglichkeit könnte eine intrinsische oder sehr rasch erworbene Resistenz gegen Triapin sein.

Während dieser Dissertation wurden triapin-resistente Zellmodelle etabliert und ein Resistenzprofil gegenüber verschiedenen klassischen und neuen Chemotherapeutika erstellt. Weiters wurde der zugrunde liegende Resistenzmechanismus erforscht. Ebenfalls wurden Triapinderivate mit strukturellen Modifikationen synthetisiert, um die Struktur-Wirkbeziehung hinsichtlich der Aktivität gegen Krebs zu etablieren. In diesem Zusammenhang wurde weiters die Möglichkeit, ein Triapinresistenz zu umgehen, erforscht.

Die im Rahmen dieser Dissertation erstellten Daten zeigten deutlich, dass die Selektion der menschlichen Darmkrebszelllinie SW480 gegen Triapin zu einer massiven Hochregulierung der Expression von ABCB1, einem Mitglied der ATP-Bindungskassette (ABC) Transporterfamilie, führt. Dieses Protein ist als sogenanntes Multidrugresistenz bekannt, da seine Überexpression eine Resistenz gegenüber vielen verschiedenen Chemotherapeutika und anderen kleinmolekularen Arzneimittel bedingt. Die Hochregulierung der mRNA sowie eine stark erhöhte Proteinexpression von ABCB1 durch Triapin-Selektion sind auf eine Promotorhypomethylierung anstelle einer häufig beobachteten Genamplifikation zurückzuführen. Obwohl Triapin selbst nur ein schwaches ABCB1-Substrat ist, wurde die stressabhängige Proteinkinase C aktiviert, welche ebenfalls für die Erhöhung von mRNA und Proteinexpression von ABCB1 bekannt ist. Durch die Inhibierung von ABCB1 konnte keine nennenswerte Resensibilisierung der Zellen gegen Triapine erreicht werden. Dies legt nahe, dass die erhöhte ABCB1-Expression nicht den ausschlaggebenden Mechanismus der erworbenen Triapinresistenz darstellt. Interessanterweise, konnten wir eine homozygote Deletion des Phosphodiesterase-4D (PDE4D) Gens in unserem Triapinresistenz-Modell nachweisen. PDE4D ist ein Negativregulator des zyklischen Adenosinmonophosphat-Signalwegs (cAMP). Unsere Daten zeigten interessanterweise, dass nicht die cAMP-PKA-Creb Signalachse an der Resistenz gegen Triapin beteiligt ist, sondern der zweite Effektor von cAMP, nämlich exchange protein activated by cAMP (Epac) aktiviert wird. Epac aktiviert in Folge Ras-related protein 1 (Rap1) und dies führt weiter zu einer veränderten Expression von Integrinen. Die Inhibierung eines dieser Schritte ist ausreichend, um eine signifikante Resensibilisierung der resistenten Zellen gegen Triapin zu induzieren. Zusätzlich wurden acht verschiedene Triapinderivate durch schrittweise Methylierung der Aminogruppen synthetisiert und auf ihren Wirkmechanismus getestet. Die neu synthetisierten Derivate zeigten eine unterschiedliche Wirkungsweise im Vergleich zu Triapin. Ebenfalls konnte mit den dimethylierten Substanzen (entweder an der terminalen Aminogruppe oder am Pyridin-NH2) die erworbenen Triapinresistenz umgangen werden.

Zusammenfassend verdeutlicht diese Arbeit, dass die Induktion einer ABCB1 Überexpression zwar nicht der wichtigste Mediator einer Triapinresistenz ist, aber in der klinischen Praxis, vor allem nach dem Misserfolg von Triapin und bei Kombinationstherapien, berücksichtigt werden sollte. Ein zentraler Resistenzmechanismus von Triapin basiert auf der cAMP-Epac-Rap1-Integrin-Signalachse und erlaubt die Entwicklung von Kombinationsstrategien, um die Unempfindlichkeit von soliden Tumoren gegen Triapin zu überwinden. Die neu synthetisierten Derivate von Triapin zeigten zusätzlich vielversprechende Aktivität in verschiedenen Tumorzelllinien und konnten die Triapinresistenz umgehen. Daher sollten diese Verbindungen für weitere (prä-) klinische Studien als therapeutische Option in Betracht gezogen werden.

Abstract (English)

Cancer cells are characterized by a high proliferation rate and therefore enhanced vulnerability due to an excessive need of deoxyribonucleotides. Ribonucleotide reductase (RR) is an important enzyme involved in the conversion of ribonucleotides to deoxyribonucleotides. Because of this rate-limiting step during DNA de novo synthesis, RR seems to be a suitable target for the treatment of cancer. The second subunit R2 of the RR contains a diferric iron center stabilizing a tyrosyl radical. With the aim to target this iron center, several different classes of iron chelators have been developed in the last decades. The most promising candidates of iron chelators belong to the class of thiosemicarbazones. This resulted in the clinical evaluation of Triapine (3-aminopyridine-2-carboxaldehyde thiosemicarbazone), which showed promising activity in clinical Phase I and II studies against advanced leukemia. In contrast, no significant response was observed in patients with solid tumors (neither single nor combination treatment). The reasons for this inefficacy are widely unknown. One possibility could be intrinsic or very rapidly acquired drug resistance.

In this thesis, Triapine-resistant cell models were generated and a cross-resistance profile was established. Moreover, the underlying resistance mechanisms were characterized. In addition, Triapine derivatives with structural modifications were developed and investigated with respect to their structure-activity related anticancer activity as well as their potential to circumvent Triapine resistance.

The data generated during the work of this thesis, clearly depicted that acquired Triapine resistance in the human colon cancer cell line SW480 resulted in a massive upregulation of one member of the ATP-binding cassette (ABC) transporter family, namely ABCB1. This protein is well-known to cause multidrug resistance, affecting also a broad variety of other chemotherapeutics. This distinct upregulation in mRNA levels as well as strongly increased protein expression of ABCB1 resulted from promoter hypo-methylation rather than gene amplification. Although Triapine itself is only a weak ABCB1 substrate, it activates the stress-responsible protein kinase C which was identified as driver for enhanced mRNA and protein expression of ABCB1. Unfortunately, inhibition of ABCB1 did not result in re-sensitizing the cells against Triapine leading to the conclusion that increased ABCB1 expression is not the main resistance mechanism in Triapine resistance. However, we further uncovered that acquired Triapine resistance was paralleled by homozygous deletion of the phosphodiesterase 4D (PDE4D) gene. PDE4D is the negative regulator in the cyclic adenosine monophosphate (cAMP) pathway. Our data revealed, that not the major downstream target of cAMP, protein kinas A (PKA), is the driving resistance against Triapine, but the second effector of cAMP, namely exchange protein activated by cAMP (Epac). The activated Epac resulted in activation of Ras-related protein 1 (Rap1) and, furthermore, led to altered expression of integrins. Inhibition of one of these steps led to robust re-sensitization of the resistant cell line to Triapine. In addition, the stepwise methylation of Triapine resulted in eight different derivatives with a different mode of action in comparison to the parental drug. Moreover, dimethylation either on the terminal amino group or on the pyridine NH2 moiety circumvented Triapine resistance.

In summary, the data presented in this thesis revealed that - although ABCB1 is not the major player in Triapine resistance ABCB1 induction has to be considered in clinical practice after Triapine failure and for settings of combination therapy. The proposed resistance mechanism for Triapine is hyperactivation of the cAMP-Epac-Rap1-integrin signaling axis and, therefore, suitable combination strategies have to be considered to overcome Triapine insensitivity of solid tumors. Alternatively, the novel synthesized derivatives of Triapine showed promising activity and were able to circumvent Triapine resistance and these compounds have to be considered for further (pre)clinical evaluation as novel therapeutic options.

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