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Bibliographic Metadata

Title
Understanding degradation of neutrophil extracellular traps / submitted by Nikolai Staier
AuthorStaier, Nikolai
Thesis advisorLang, Irene Marthe
Published2018
Description55 Blatt : Diagramme
Institutional NoteMedizinische Universität Wien, Diplomarb., 2018
Date of SubmissionMay 2018
LanguageEnglish
Document typeThesis (Diplom)
Keywords (DE)Neutrophil Extracellular Traps / DNase
Keywords (EN)Neutrophil Extracellular Traps / DNase
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-13522 Persistent Identifier (URN)
Restriction-Information
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Understanding degradation of neutrophil extracellular traps [2.11 mb]
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Abstract (German)

Studienhintergrund

Neutrophil extracellular traps (NETs) sind von Neutrophilen gebildete netzartige Strukturen, welche cytotoxisch und prothrombotisch wirksam sind. Der Abbau von NETs erfolgt überwiegend durch das Enzym Deoxyribonuklease 1 (DNase 1). Ein verminderter NET-Abbau ist assoziiert mit kardiovaskulären Ereignissen und erhöhter Myokardinfarktgröße. Prozesse welche den NET-Abbau beeinflussen sind bisher nicht ausreichend erforscht, jedoch gibt es diverse Substanzen welche die Aktivität von DNase 1 beeinflussen. Voraussetzung für einen effizienten DNA-Abbau der DNase 1 ist der freie Zugang zum DNA Strang, welcher durch die Histon-DNA Verbindung limitiert ist. Mit der Etablierung eines robusten Assay, versuchen wir ein besseres Verständnis des NET-Abbaus zu erlangen und identifizieren neue Substanzen welche diesen Prozess beeinflussen.

Methoden

Nach Isolation der Neutrophilen wurden diese mit Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) stimuliert und somit die NETose induziert. Anschließend wurde DNase 1 und die jeweiligen Substanzen zur Einleitung des NET Abbaus hinzugefügt. Die hierbei entstandenen doppelsträngigen DNA (dsDNA) Fragmente sowie der Überstand wurden in eine 96-Well Platte transferiert. Danach wurde die dsDNA mithilfe von PicoGreen, einem fluoreszierenden Nukleinsäurenfarbstoff und einem Lumineszenzgerät ausgewertet.

Ergebnisse

Wir konnten einen robusten DNase 1-mediierten Assay zur Evaluierung des NET-Abbaus etablieren. Heparin, Thrombin, Plasmin, Heparansulfat und Polysialinsäure (PSA) beeinflussten den NET-Abbau signifikant. Actin verminderte die Fähigkeit der DNase 1 NETs abzubauen, während Granzym A und aktiviertes Protein C keine Auswirkungen auf den NET Abbau hatten.

Zusammenfassung

Der Assay und die gewonnen Ergebnisse könnten zu einem besseren Verständnis des NET-Abbaus führen. Die Histon-Interaktion scheint eine Schlüsselrolle im Zusammenhang mit dem Abbau von NETs zu spielen, jedoch bleiben die exakten Mechanismen dieser Interaktion noch zu definieren. Der neu etablierte Assay könnte ein wichtiges Werkzeug bei der Identifizierung weiterer Substanzen sein, welche entscheidend sein könnten für zukünftige therapeutische Ansätze mit DNase 1.

Abstract (English)

Introduction

The formation of neutrophil extracellular traps (NETs) is an effector mechanism of neutrophils. Degradation of NETs is predominantly mediated by deoxyribonuclease 1 (DNase 1). Impaired NET degradation is related to cardiovascular events and increased myocardial infarct size. Processes influencing NET degradation are poorly understood, but several agents are known to modify DNase 1 activity. Efficient DNA cleavage by DNase 1 is dependent on accessibility of the DNA strands, which is limited by the histone-DNA conjunction. By establishing a robust assay, we seek to further investigate NET degradation and identify new factors influencing this process.

Methods

Neutrophils were stimulated with phorbol myristate acetate (PMA) to generate NETs in 48-well culture plates. DNase 1 and respective reagents were added. After degradation of NETs and release of double-stranded DNA (dsDNA) fragments, supernatants were transferred to a 96-well plate and measured utilizing PicoGreen ®, a fluorescent nucleic acid stain. Lambda DNA served as a positive control and dsDNA levels were measured on a luminescence reader.

Results

We were able to establish a robust assay to test DNase 1-mediated NET degradation. Substances significantly influencing NET degradation were heparin, thrombin, plasmin, heparan sulfate and polysialic acid (PSA). Actin had an impact on the capability of DNase 1 to degrade NETs, whereas granzyme A and activated protein C (APC) did not alter NET degradation.

Conclusion

Our assay and initial results might contribute to a better understanding of the degradation of NETs. Interaction with histones is a key feature of substances modulating NET degradation, yet the exact mechanisms of these interactions remain to be specified. The established assay will help to test various agents which could be crucial for future therapeutic attempts.

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