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Bibliographic Metadata

Title
Radioliganden-Bindungsstudie an 5-hältigen GABAA-Rezeptoren : Welche Aminosäuren sind verantwortlich für die 5-Selektivität mancher Benzodiazepine? / eingereicht von Markus Müllegger
Additional Titles
Radioligand binding study on 5-containing GABAA receptors - Which amino acids are responsible for the 5-selectivity of some benzodiazepines?
AuthorMüllegger, Markus
Thesis advisorScholze, Petra
Published2018
Description66 Blatt : Diagramme
Institutional NoteMedizinische Universität Wien, Diplomarb., 2018
Annotation
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Date of SubmissionMay 2018
LanguageGerman
Document typeThesis (Diplom)
Keywords (DE)GABA / Benzodiazepine / 5-hältiger GABAA-Rezeptor / 5-Untereinheit / 5-Selektivität / SH-053-2'F-R-CH3 / SH-053-2'F-R-COOH / MP-III-022 / [3H]Ro 15-4513 / [3H]Flunitrazepam / subtyp-selektive Wirkstoffe / Radioligandenbindungsassay / Hemmkurve / Scatchard-Assay / Sättigungskurve / Cheng-Prusoff-Gleichung / Benzodiazepin-Bindungsstelle / GABAA-Rezeptor-Subtyp / Subtyp-Hypothese / Loop B / Loop C / 5(P197T)32 / 5(T239S)32 / 3(T215P)32 / 3(S257T)32 / 3(wt)32 / 5(wt)32 / GABAA-Rezeptor-Mutante / HEK293-Zellen / Transfektion / Radioligand / allosterischer Modulator / IC50 / Kd-Wert / Ki-Wert
Keywords (EN)GABA / benzodiazepines / 5-containing GABAA receptor / GABAA receptor subtype / subunit / subtype-selective drugs / 5-selectivity / SH-053-2'F-R-CH3 / SH-053-2'F-R-COOH / MP-III-022 / [3H]Ro 15-4513 / [3H]Flunitrazepam / radioligand binding assay / scatchard assay / Cheng-Prusoff relationship / benzodiazepine binding site / benzodiazepine binding pocket / subtype hypothesis / Loop B / Loop C / 5(P197T)32 / 5(T239S)32 / 3(T215P)32 / 3(S257T)32 / 3(wt)32 / 5(wt)32 / GABAA receptor mutant / HEK293-cells / transfection / allosteric modulation / IC50 / Kd / Ki
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-14126 Persistent Identifier (URN)
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 The work is publicly available
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Radioliganden-Bindungsstudie an 5-hältigen GABAA-Rezeptoren [11.57 mb]
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Abstract (German)

GABA ist der wichtigste inhibitorische Neurotransmitter des zentralen Nervensystems. Beim zugehörigen GABAA-Rezeptor handelt es sich um einen ionotropen, ligandengesteuerten Chloridionenkanal. Dieser Rezeptor ist ein Homo- oder Heteropentamer, das aus 19 verschiedenen Untereinheiten aufgebaut werden kann. Benzodiazepine binden an eine Bindungsstelle, die aus der +- und --Seite (meistens 2-) der zwei Untereinheiten geformt wird. Klassische Benzodiazepine binden aber meist nur an folgende Rezeptor-Konfigurationen: 1n2, 2n2, 3n2, 5n2. Laut der Subtyp-Hypothese vermitteln die einzelnen -Untereinheiten verschiedene pharmakologische Wirkungen. 1 wirkt sedativ, antikonvulsiv, suchterzeugend und anterograd-amnestisch, 2 wirkt anxiolytisch und muskelrelaxierend, 3 anxiolytisch, 5 antipsychotisch, amnestisch und suchterzeugend. Klassische Benzodiazepine werden bereits erfolgreich bei Angst- und Spannungszuständen, Insomnie, Muskelspasmen, Epilepsie oder bei Alkoholentzugssyndrom eingesetzt, sie besitzen allerdings keine Subtyp-Selektivität, was zu unerwünschten Nebenwirkungen wie Sucht- und Toleranzentwicklung oder Sedierung führt. Subtyp-selektive Wirkstoffe erweitern möglicherweise das therapeutische Spektrum bei einer Reduktion der Nebenwirkungen. 5-selektive Substanzen könnten wahrscheinlich zur Behandlung von Alzheimer, Schizophrenie, Autismus, Down-Syndrom oder Asthma geeignet sein. Die 5-Untereinheit weist im Vergleich zu den Untereinheiten 1, 2 und 3 Unterschiede in den Aminosäuresequenzen an der Benzodiazepin-Bindungsstelle auf. Ziel dieser Diplomarbeit war es, zu untersuchen, welche Aminosäuren für die 5-Selektivität verantwortlich sein könnten. Ein Sequenzvergleich zwischen den Untereinheiten 1, 2, 3 und 5 gab Hinweis auf 2 Aminosäuren, die möglicherweise bei 5-hältigen-GABAA-Rezeptoren zu einer erleichterten Bindung gewisser Benzodiazepine führen könnten: Das am B-Loop der Benzodiazepin-Bindungsstelle lokalisierte Prolin an der Stelle 197 und das am C-Loop vorkommende Threonin an der Stelle 239 (Die 25 Aminosäuren des Signalpeptids wurde nicht mitgezählt). HEK-293-Zellen wurden mit mutierten und Wildtyp-GABAA-Rezeptoren transfiziert: 5(P197T)32, 5(T239S)32, 3(T215P)32, 3(S257T)32, 3(wt)32 und 5(wt)32. Bei den mutierten Rezeptoren wurde hierbei jeweils eine Aminosäure der 5-Untereinheit mit einer homologen Aminosäure der 3-Untereinheit ersetzt. Im Umkehrschluss wurde dies auch bei den mutierten 3-Untereinheiten durchgeführt. Dann wurde die Affinität der 5-selektiven Substanzen SH-053-2'F-R-CH3, SH-053-2‘F-R-COOH und MP-III-022 zu den exprimierten Rezeptoren der HEK293-Zellen durch Messung der Verdrängung des Radioliganden [3H]Ro 15-4513 getestet. Es kann anhand aller drei Substanzen vermutet werden, dass das Prolin an der Stelle 197 am B-Loop keine Bedeutung für die 5-Selektivität hat. Auch der 3-Rezeptor 3(T215P)32 erhielt durch den Einbau eines Prolins statt eines Threonins keine erhöhte 5-Selektivität. Bei Loop C gibt es Hinweise, dass das Threonin an der Stelle 239 für die 5-Selektivität des 5-GABAA-Rezeptors verantwortlich ist. Die 5-Untereinheit hatte durch den Austausch des Threonins an der Stelle 239 durch ein Serin eine geringere Affinität für die 5-selektive Substanz SH-053-2'F-R-COOH. Wurde beim 3-hätigen Rezeptor 3(S257T)32 das Serin durch ein Threonin getauscht, zeigte er eine höhere Affinität zu SH-053-2'F-R-COOH. Bei SH-053-2'F-R-CH3 und MP-III-022 war bei 5T239S-32 im Vergleich zum 5-hältigen Wildtyp ein möglicher Trend in Richtung Affinitätsabnahme erkennbar.

Abstract (English)

In the mammalian nervous system, GABAA receptors exist in an enormous diversity of subtypes. Six , three , three , the , , , , and three subunits can and most of them actually do assemble into a multitude of different homo- or hetero-pentameric receptors, each of them displaying unique pharmacological properties. These receptors are targeted by various clinically relevant drugs such as for example the widely prescribed benzodiazepines, which can exert many different effects, including anxiolytic, sedative, hypnotic, amnesic, anticonvulsant, and muscle relaxant effects. The different benzodiazepine-induced behavioural responses seem to be predominantly mediated by GABAA receptors subtypes containing specific subunits having their effects mostly on the following receptors-configurations: 1n2, 2n2, 3n2 and 5n2. This leads to the search for novel ligands that discriminate between different -containing receptors. Since 5-containing GABAA receptors are located in the hippocampus, 5-selective positive allosteric modulators are expected to have negative effects on memory and cognition, while negative allosteric modulators are thought to improve cognition and memory and might possibly be a future treatment of Alzheimers, schizophrenia, Down-syndrome, autism and other related diseases. Some 5-preferring (selective) compounds have already been identified, such as SH-053-2'F-R-CH3, SH-053-2‘F-R-COOH and MP-III-022. The aim of the current study was to learn more about the molecular determinants and the associated amino acids of the GABAA receptors that lead to 5-selectivity. A sequence alignment of the subunits 1, 2, 3 and 5 indicates that two amino-acids located in the B and C loop of the 5-subunit might contribute to subtype selectivity: P197 in B loop and T239 in C loop. Therefore, wildtype and point mutated subunits have been constructed and expressed in transfected HEK-293 cells: 5(P197T)32, 5(T239S)32, 3(T215P)32, 3(S257T)32, 3(wt)32 und 5(wt)32. The receptors were tested using radioligand binding assays by measuring the displacement of [3H]Ro 15-4513 by the 5 selective compounds SH-053-2'F-R-CH3, SH-053-2‘F-R-COOH and MP-III-022. In this study there was no evidence that the amino acid P197 in the alpha5 subunit in B loop is responsible for the 5-selectivity. However, SH-053-2‘F-R-COOH showed in comparison with the 5- or 3-wildtype a lower affinity to the C loop mutant 5(T239S)32 and higher affinity to C loop mutant 3(S257T). Accordingly, the amino acid 5 T239 in loop C could be a determinant of 5 - binding selectivity.

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