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Titelaufnahme

Titel
Refined analytical methods for improved component resolved diagnosis in food allergy / submitted by Pawel Dubiela
Weitere Titel
Optimierte Analysemethoden zur Verbesserung der Komponente-Diagnose von Nachrungsmittelallergien
Verfasser / VerfasserinDubiela, Pawel
GutachterHoffmann-Sommergruber, Karin
Erschienen2018
Umfang125 Seiten : Illustrationen
HochschulschriftMedizinische Universität Wien, Diss., 2018
Anmerkung
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Datum der AbgabeJanuar 2018
SpracheEnglisch
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Nahrungsmittelallergien
Schlagwörter (EN)Food allergy
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-18923 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Werk ist frei verfügbar
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Refined analytical methods for improved component resolved diagnosis in food allergy [11.78 mb]
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Nachweis
Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Komponenten-basierte Tests tragen zu einer verbesserten Diagnosestellung für Nahrungsmittelallergien. Dies ist umso wichtiger, da es derzeit keine zugelassene Immuntherapie bei Nahrungsmittelallergien gibt. Daher ist die Identifizierung der allergieauslösenden Nahrungsmittel wichtig, um geeignete Diätpläne zu erstellen.

In der jüngsten Vergangenheit hat sich die Allergieforschung zusätzlich zur Identifizierung einzelner Nahrungsmittelallergene auch mit der Zusammensetzung der Nahrungsmittelmatrix und deren Einfluss auf die Allergenizität der einzelnen Proteine beschäftigt. Diese Untersuchungen helfen das Wissen über „natürliche“ Adjuvantien, die in Nahrungsmitteln vorkommen, zu vertiefen.

Im ersten Teil der PhD Thesis wurde eine umfassende Studie über die Interaktion des Hauptallergens aus Pfirsich, Pru p 3 (nichtspezifisches Lipid-transfer-protein), und Lipiden durchgeführt um die Rolle der Nahrungsmittelmatrix bei Pfirsichallergie zu verstehen.

Die Lipidbindung von gereinigtem Pru p 3 wurde im „ANS Test“, untersucht. Weiters wurde die Lipidbindung mittels NMR „Water-Ligand Observed Gradient NMR Spektroskopie“ analysiert. Parallel zu den experimentell erhobenen Daten wurde eine „in-silico“ Analyse mittels „Molecular Dynamics“ durchgeführt. Anschließend wurde der Einfluss der Lipid-Allergen Interaktion auf die IgE-Bindungsfähigkeit von Pru p 3 in „ELISA“ und „BAT“ Tests mit Hilfe von Seren von Pfirsichallergikern untersucht.

Die Resultate des ANS Tests und der NMR-Experimente ergaben, dass Pru p 3 präferentiell ungesättigte freie Fettsäuren, wie Ölsäure bindet. Diese Interaktion verändert die dreidimensionale Struktur von Pru p 3, wie auch mit Hilfe von Molecular Dynamics errechnet wurde. Die „C-terminale Loop“ wird nach außen, Richtung Oberfläche gedreht und ändert damit die Zugänglichkeit eines bereits bekannten IgE-Epitops. Damit erhöht diese Konformationsänderung die IgE-Bindung signifikant im Vergleich zu Pru p 3 ohne Ligandenbindung. Diese Konformationsänderung ist aber abhängig vom Liganden und nicht alle Bindungen führen zu einer erhöhten IgE Bindungsaktivität von Pru p 3.

Walnüsse wie auch andere Baumnüsse sind eine der häufigsten Verursacher von schweren, anaphylaktischen Reaktionen. Daher wurden im zweiten Teil der PhD Thesis Allergene aus Walnuss biochemisch untersucht. Mittels spezifischer Hochleistungs-Spektrometrie Methoden wurden einzelne Allergene detailliert charakterisiert.

Ein Protein aus der Familie der Viciline wurde aus Walnusskernen gereinigt und anschließend mittels Massenspektrometrie charakterisiert. Die allergenen und kreuzreaktiven Eigenschaften des Proteins wurden im Immunblot und ELISA an 77 Seren von Allergikern mit Walnussallergie getestet.

Im Proteingel erscheint das gereinigte Vicilin als eine Bande in der Höhe von ca. 50kDa und wurde von IgE Antikörpern aus Seren von allergischen Patienten erkannt. MALDI-TOF und ESI-TOF Analysen ergaben eine Masse von 47.1kDa und 48.8kDa. Tandem-MS und daran gekoppelte Flüssigkeitschromatographie ermöglichte die Sequenzierung des Proteins. Die Sequenz dieses Proteins stimmte jedoch nicht mit der vom bereits bekannten Vicilin aus Walnuss, Jug r 2, überein. Daher wurde für dieses neue Protein der Allergenname Jug r 6 von der IUIS Allergendatenbank zuerkannt. Weiters wurde für Jug r 6 Kreuzreaktivität zu den homologen Allergenen aus Haselnuss, Sesam und Pistazie gefunden, die auch der Sequenzhomologie mit diesen Proteinen entspricht.

Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Anwendung von speziellen hochsensitiven Analysemethoden die Identifizierung von einzelnen Allergenen verbessert. Diese gut charakterisierten Allergene können damit die Sensitivität und Spezifität der molekülbasierten Allergiediagnostik verbessern, die im weiteren dazu beitragen, dass die entsprechenden therapeutischen Maßnahmen für den Patienten mit Nahrungsmittelallergien optimiert werden können.

Zusammenfassung (Englisch)

Component resolved tests contribute to improved diagnosis for food allergies and facilitate an individual management of patients. This is of utmost importance since there is no approved immunotherapy for food allergies available. The identification of causative allergens and allergenic foods is essential in order to formulate individual exclusion diets.

In the recent past allergy research has focused on the identification of food allergens and in addition started to investigate the composition of food matrices and its impact on the allergenicity of individual allergens. These studies contribute to further expand our knowledge on “natural” adjuvants from food sources.

In the first study of the PhD Thesis a comprehensive study on the interaction of the major peach allergen Pru p 3 (non-specific lipid transfer protein) and lipids was performed to better understand the role of lipid-food matrix in peach allergy.

Lipid-binding activity of purified Pru p 3 was monitored by fluorescence-based ANS assay and Water-Ligand Observed via Gradient NMR Spectroscopy. In addition to the experimental approach an in silico assessment was performed, applying Molecular Dynamics.

Subsequently, the impact of this interaction on the IgE binding activity of Pru p 3 was investigated using sera from peach allergic patients in ELISA and BAT assays.

Our results showed that Pru p 3 preferentially binds unsaturated free fatty acids such as oleic acid as shown by ANS assay and verified by NMR experiments. This interaction between oleic acid and Pru p 3 affects its 3D structure as indicated by molecular dynamic analysis.

The C-terminal loop is moved out towards the surface of the molecule thus changing accessibility of a known IgE epitope. Thus this conformational change significantly increases the IgE binding capacity of Pru p 3. However, this conformational change is also dependent on the type of ligand and not all lipids tested increased the IgE binding activity of Pru p 3.

Among those walnuts like other tree nuts are ranked high in the list of the culprit foods inducing severe reactions including anaphylaxis. Therefore allergens from walnuts were characterized in the second part of the PhD Thesis applying high throughput mass

spectrometry.

A member of the vicilin protein family was purified from walnut kernels and further characterized by mass spectrometry. Heat and enzymatic stability of the purified protein was investigated by CD-spectroscopy and gastrointestinal digestion simulation, respectively.

Allergenicity and cross-reactivity of the target protein was verified by immunoblots and ELISA using sera from 77 walnut allergic patients. In SDS-PAGE purified vicilin migrated as a single band of about 50 kDa and was recognized by specific IgE from allergic patients sera in Western blots. MALDI-TOF and ESI-TOF analyses provided mass data of 47.1 kDa and 48.8 kDa, respectively. Tandem mass spectrometry coupled with liquid chromatography allowed the identification of the protein sequence. However, the obtained amino acid sequence was not in accordance with the previously identified walnut vicilin, Jug r 2. Therefore, this vicilin obtained the allergen designation Jug r 6 from the IUIS allergen nomenclature database. Jug r 6 displays a remarkable level of cross reactivity when tested with homologues from hazelnut, sesame seed and pistachio, which is also reflected by the sequence similarity.

Summarizing we showed that the application of refined analytical methods can improve the identification and characterization of individual allergens. These well-defined allergenic molecules contribute to increase the sensitivity and specificity of component resolved diagnosis, which in turn improves patient tailored management. Therefore, up to date analytical methods should be included for in depth allergen characterization prior to their application in food allergy component resolved diagnosis.

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