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Bibliographic Metadata

Title
Differences in growth properties among distinct human cytomegalovirus glycoprotein O genotypes / submitted by Julia Kalser
Additional Titles
Unterschiede in den Wachstumseigenschaften zwischen verschiedenen Glykoprotein O Genotypen des humanen Zytomegalovirus
AuthorKalser, Julia
Thesis advisorGörzer, Irene
Published2018
Descriptionxiv, 91 Seiten : Illustrationen
Institutional NoteMedizinische Universität Wien, Diss., 2018
Annotation
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Date of SubmissionMay 2018
LanguageEnglish
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)Humanes Zytomegalievirus / Stamm / Glykoprotein O / Glykoproteinkomplex / Fibroblasten / Epithelzellen / Zelltropismus / Genotyp
Keywords (EN)Human Cytomegalovirus / strain / glycoprotein O / glycoprotein complex / fibroblasts / epithelial cells / cell tropism / genotype
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-17025 Persistent Identifier (URN)
Restriction-Information
 The work is publicly available
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Differences in growth properties among distinct human cytomegalovirus glycoprotein O genotypes [10.56 mb]
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Classification
Abstract (German)

Das humane Zytomegalievirus (HCMV) ist ein weltweit verbreitetes Pathogen, das für immunkompetente Menschen meist ungefährlich ist, jedoch bei kongenital infizierten Neugeborenen und immungeschwächten Patienten schwere Erkrankungen und Komplikationen auslösen kann. Häufig kommt es zu Reinfektionen mit verschiedenen HCMV Stämmen, und da das Virus lebenslang im Körper bleibt, sind viele Menschen mit mehr als einem HCMV Stamm infiziert. HCMV kann ein breites Spektrum an Zelltypen befallen und verwendet für den Eintritt in die Wirtszelle mehrere seiner Hüllglykoproteine. Der trimere Glykoproteinkomplex gH/gL/gO ist essentiell für die Infektion aller anfälligen Zelltypen und dessen Untereinheit Glykoprotein O (gO) ist von zentraler Bedeutung, da es mit dem platelet-derived growth factor Rezeptor- (PDGFR-) auf Fibroblasten interagiert und in allen Zelltypen die Glykoprotein B-vermittelte Membranfusion einleitet. Es existieren acht verschiedenen Genotypen (GT) des hochpolymorphen Glykoprotein O, und obgleich sich deren Aminosäurensequenzen in bis zu 24 % voneinander unterscheiden, können alle einen stabilen trimeren Komplex bilden.

Das Ziel dieser Studie war es phänotypische Unterschiede zwischen verschiedenen gO Genotypen zu identifizieren. Dafür wurde im HCMV Stamm TB40-BAC4-luc die gO GT1c Sequenz durch die Sequenz von gO GT3, GT4 und GT5 ersetzt. Die daraus hervorgehenden Virusmutanten wiesen einen vollständigen (GT4) oder partiellen (GT3/1c, GT5/1c) Austausch der ursprünglichen gO GT1c-Sequenz auf. Alle Mutanten waren fähig Fibroblasten und Epithelzellen zu infizieren und in diesen Zellen zu replizieren. Die gO GT4 Mutante wies jedoch im Vergleich zum parentalen gO GT1c Stamm einen signifikant verstärkten Epithelzelltropismus auf, im Unterschied zu den chimären gO GT3/1c und gO GT5/1c Mutanten, die sich ähnlich wie gO GT1c verhielten.

Zur Untersuchung der Replikationsdynamiken in Koinfektionen wurden Fibroblasten und Epithelzellen mit Mischungen von jeweils zwei verschiedenen gO Genotypen infiziert. Die Wachstums- und DNA Kinetiken der einzelnen gO Genotypen in Koinfektionen war vergleichbar mit jenen in Einzelstamminfektionen, und wiederum war der verstärkte Epithelzelltropismus der gO GT4 Mutante zu beobachten. Keiner der gO Genotypen entwickelte ein dominantes Replikationsmuster.

Des Weiteren wurden in gO GT1c und gO GT4 zwei hoch konservierte, Trimer-stabilisierende gO Cysteine mutiert. Die gleichzeitige Mutation beider Cysteine war für beide gO Genotypen fatal und verhinderte die Produktion von Viruspartikeln. Die Mutation von jeweils einem Cystein beeinflusste bei gO GT1c weder Infektiösität noch Wachstum. Im Gegensatz dazu führten die entsprechenden Cystein Einzelmutationen bei gO GT4 zu einer stark reduzierten zellfreien Infektiösität. Außerdem hatten die gO GT4 Einzelcysteinmutanten einen substantiell niedrigeren gO Gehalt als Virionen der gO GT1c Einzelcysteinmutanten.

Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass die Grundfunktion von gO in den verschiedenen Genotypen erhalten bleibt. Interessanterweise scheint jedoch der Zelltropismus zwischen den gO Genotypen zu variieren. Die Diversität von gO beeinflusst möglicherweise die Infektiösität der verschiedenen HCMV Stämme in vivo, deren Verbreitung im Körper und die Virusübertragung auf andere Menschen. Die detaillierte Charakterisierung der verschiedenen gO Genotypen trägt somit zu einem verbesserten Verständnis dieses komplexen Virus bei und ist von zentraler Bedeutung für die Entwicklung eines effizienten Impfstoffes.

Abstract (English)

Human cytomegalovirus (HCMV) is a widespread pathogen and responsible for infections causing amongst others a variety of congenital disorders and major complications in immunocompromised patients. Reinfection with different HCMV strains is common and since the virus persists, multiple strains can accumulate in the human host. A broad range of cell types can be infected by HCMV which engages several of its envelope glycoproteins for cell entry. The trimeric glycoprotein complex gH/gL/gO is essential for infection and glycoprotein O (gO) is the crucial subunit since it triggers glycoprotein B-mediated membrane fusion in all cell types and interacts with platelet-derived growth factor receptor- (PDGFR-) present on fibroblasts. The highly polymorphic glycoprotein O circulates in eight distinct genotypes (GT) that display up to 24 % of amino acid diversity, yet are all able to form the trimeric complex. So far, however, the gO genotypes have not been extensively characterised.

In this study we aimed to identify phenotypic differences between distinct gO genotypes in the context of a replicating virus. For this purpose, the resident gO GT1c sequence of HCMV strain TB40-BAC4-luc was exclusively replaced with the gO GT3, GT4, and GT5 sequence. The resulting virus mutants displayed either full-length (GT4) or partial (GT3/1c, GT5/1c) exchange of the gO GT1c sequence. All mutants were able to infect and replicate in fibroblasts and epithelial cells, but only the gO GT4 mutant displayed significantly enhanced epithelial cell tropism when compared to parental gO GT1c strain. The chimeric gO GT3/1c and gO GT5/1c mutants were similar to gO GT1c.

Furthermore, to analyse the replication dynamics in mixed strain infections, combinations of two gO genotypes at a time were used to infect fibroblasts and epithelial cells. The growth and DNA kinetics of the individual gO genotypes were similar to those observed in single strain infections, and the enhanced epithelial cell tropism of gO GT4 was equally detected in mixed infections. Moreover, no gO genotype developed a dominant replication pattern.

Finally, in gO GT1c and gO GT4 two distinct highly conserved, trimer-stabilising gO cysteines were mutated. The simultaneous mutation of both cysteines was detrimental in both gO genotypic backgrounds. However, while single mutation of the cysteines did not affect infectivity and growth of gO GT1c, the corresponding single cysteine mutations in gO GT4 lead to markedly reduced cell-free infectivity. Additionally, the gO GT4 single cysteine mutants displayed substantially lower amounts of gO in their virions than the gO GT1c single cysteine mutants.

In summary, our findings provide evidence that the basic functions of gO are preserved among the distinct gO genotypes. Nonetheless, most interestingly, the cell tropism seems to vary between the gO genotypes and infectivity, intra-host spread and inter-host transmission of the various HCMV strains may in vivo be influenced by the diversity of gO. In conclusion, the detailed characterisation of the different gO genotypes contributes to our understanding of this complex virus and is of crucial importance for efficient vaccine development.

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