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Title
Analysis of HIV drug resistance by deep sequencing technology / eingereicht von Benjamin Markus Friedel
Additional Titles
Analyse von HIV-Resistenzen mittels Deep Sequencing-Technologie
AuthorFriedel, Benjamin Markus
Thesis advisorPuchhammer, Elisabeth
Published2018
Description117 Seiten : Diagramme
Institutional NoteMedizinische Universität Wien, Diplomarb., 2018
Annotation
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Date of SubmissionJuly 2018
LanguageEnglish
Document typeThesis (Diplom)
Keywords (EN)Next Generation Sequencing / Sanger Sequencing / Deep Sequencing / NGS / Minority HIV variants / HIV drug resistance / Drug resistance testing / Genotyping / Drug Resistance Mutations
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Abstract (German)

Seit der erfolgreichen Einführung der antiretroviralen Therapie in der Behandlung der HIV Infektion stellt die Entwicklung von Arzneimittelresistenzen ein bekanntes Problem dar. Daher ist die HIV-Resistenztestung ein wichtiger Bestandteil des umfassenden Behandlungskonzepts. Momentan ist die Sanger-Sequenzierung die Standardmethode, um eine genotypische Resistenztestung durchzuführen. Allerdings können nur genetische Varianten identifiziert werden, die in ca. 20% oder mehr der viralen Quasispecies präsent sind. In den vergangenen Jahren wurden neue Verfahren entwickelt, die unter dem Begriff Tiefensequenzierung oder Sequenzierung der nächsten Generation (Next Generation Sequencing NGS) subsummiert werden. Ein möglicher Vorteil dieser Technologie ist, dass sie den Nachweis von Varianten ermöglicht, die nur in einem geringen Teil bis zu 1% und weniger der Viruspopulation vorhanden sind.

Diese Arbeit wurde als Methodenvergleich durchgeführt, um die NGS-Technologie erstmalig in das HIV-Labor des Zentrums für Virologie der Medizinischen Universität Wien einzuführen. Als Hauptzielgröße war zu überprüfen, ob die NGS-Technologie Resistenzmutationen nachweisen kann, die von der Sanger-Sequenzierung nicht erfasst wurden. Zu diesem Zweck wurden die Daten der routinemäßig durchgeführten Resistenztestung mittels Sanger-Sequenzierung aus der Datenbank der Virologie abgerufen. Die dazugehörigen, gelagerten Plasmaproben wurden aus der Serumbank entnommen und einer erneuten NGS-basierten Resistenztestung unterzogen. Die Auswertung und Interpretation der Ergebnisse der NGS-basierten Resistenztestung wurden im Vergleich zu den routinemäßig mittels Sanger-Sequenzierung erhobenen Ergebnissen der Resistenztestung durchgeführt.

84 Proben von 38 Patienten wurden entsprechend der Einschlusskriterien ausgewählt und erfolgreich mit dem Illumina® MiSeq NGS-System erneut getestet. Die gepaarten Datensätze der Sanger-Sequenzierung und NGS Genotypisierung wurden aus denselben Plasmaproben generiert. Die Sequenzierung umfasste die Region der Protease (Prot) und der Reversen Transkriptase (RT) auf dem HIV-1 Genom. Die routinemäßig mittels Sanger-Sequenzierung und erneut mittels NGS generierten Konsensussequenzen im FASTA-Dateiformat wurden mit dem Algorithmus des HIV Drug Resistance Database Program der Stanford Universität eingehend auf Resistenzmutationen überprüft. Die Ergebnisse dieser Resistenzanalyse wurden auf Übereinstimmung und Unterschiede zwischen den beiden Verfahren untersucht. Der Fokus lag besonders auf der Analyse von Resistenzmutationen, die nur von einem der beiden Sequenzierverfahren nachgewiesen wurden.

Insgesamt erfasste die Sanger-Sequenzierung 172 und die NGS-Technologie 189 resistenz-assoziierte Mutationen (RAM). Die meisten dieser RAM wurden in der NRTI-Arzneimittelklasse nachgewiesen, gefolgt von der NNRTI-Klasse, wohingegen RAM in der PI-Klasse weniger häufig detektiert wurden. 164 RAM wurden von beiden Sequenziermethoden übereinstimmend nachgewiesen. Unterschiede zwischen den Ergebnissen der Genotypisierung wurden in 24 Proben beobachtet. 8 RAM wurden ausschließlich mittels Sanger-Sequenzierung entdeckt, wohingegen 25 RAM ausschließlich durch die NGS-Technologie identifiziert wurden. In 38 unabhängigen Proben erreichte der quantitative Unterschied der RAM zwischen den Resultaten der Sanger-Sequenzierung und der NGS-Technologie nicht das gesetzte Signifikanzniveau, zeigte jedoch eine Tendenz in Richtung der NGS-Technologie.

Diese einleitende Studie konnte erste vielversprechende Ergebnisse liefern, jedoch müssen diese mit einer nachfolgenden Überprüfung noch untermauert werden. Für die Anwendung der NGS-Technologie in der klinischen Routinediagnostik ist es außerdem wichtig, ein standardisiertes Vorgehen zu entwickeln, um Mutationen die nur in einem geringen Anteil der Viruspopulation vorliegen („minority variants“) in die Therapieentscheidung einfließen zu lassen.

Abstract (English)

Background: Since the successful introduction of antiretroviral therapy in the management of HIV infection, development of drug resistance has been a common issue. Both transmitted and acquired HIV drug resistance may occur in a considerable proportion of patients. Therefore, HIV drug resistance testing is an important tool in a comprehensive treatment concept. Currently, Sanger Sequencing based genotyping is the widely used standard method for HIV drug resistance testing. However, only the more common variants present in more than 20% of the viral quasispecies may be detected by this method. In the recent years the Deep or Next Generation Sequencing (NGS) technology was evaluated and increasingly utilised for HIV drug resistance testing. One possible advantage of NGS is its ability to detect so-called minority HIV variants present down to less than 1% of the viral quasispecies.

Study design: The present work was conducted as a method comparison study for the first introduction of an NGS system into the HIV laboratory of the Department of Virology at the Medical University Vienna. The main objective was to ascertain, if NGS is capable of detecting more Drug Resistance Mutations (DRMs) in comparison to Sanger Sequencing. For this purpose, data obtained by routine Sanger Sequencing based HIV-1 drug resistance testing were recalled from the virological database. The corresponding plasma samples were collected from the serum bank and re-submitted to NGS based drug resistance testing. Assessment and interpretation of the NGS genotyping results were performed in comparison to the results obtained by Sanger Sequencing based drug resistance testing.

Methods: 84 samples from 38 patients were selected according to the inclusion criteria and successfully re-tested by Illumina® MiSeq NGS. The paired Sanger Sequencing and NGS genotyping data were independently generated from the same plasma specimens and included sequencing of the Protease (Prot) and Reverse Transcriptase (RT) regions of the HIV-1 genome. The consensus sequences previously generated by routine Sanger Sequencing and newly extracted with NGS in the FASTA file format were scrutinised for DRMs by the Stanford University HIV Drug Resistance Database Program Algorithm. The genotyping results were analysed for concordance and differences. Particular attention was payed to DRMs exclusively detected by one of the sequencing methods.

Results: In total, Sanger Sequencing detected 172 and NGS 189 DRMs. Most of the DRMs were found in the NRTI class, followed by the NNRTI class, while PI DRMs were detected less frequently. 164 DRMs were concordantly identified by both sequencing techniques. Differences between the genotyping results were observed in 24 samples. Sanger Sequencing exclusively detected 8 DRMs, whereas NGS exclusively identified 25 DRMs. In a subset of 38 independent samples, the quantitative difference regarding the number of DRMs between the Sanger Sequencing and NGS genotyping results did not reach the set significance level, however, showed a trend in favour of NGS.

Conclusion: Although this preliminary study showed promising first results in favour of NGS, the results require corroboration by a subsequent study, including simultaneous sample preparation for Sanger Sequencing and NGS to increase the comparability of the genotyping results. Further studies should also focus on the development of a standardised approach to handle the detection of minority variant DRMs in clinical routine.

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