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Bibliographic Metadata

Title
Functional proteomic and biochemical studies on the ABL1 tyrosine kinase and nuclear multiprotein complexes / submitted by Roberto Giambruno
Additional Titles
Functional proteomic and biochemical studies on the ABL1 tyrosine kinase and nuclear multiprotein complexes
AuthorGiambruno, Roberto
CensorSuperti-Furga, Giulio
Published2013
DescriptionXII, 107 Bl. : graph. Darst.
Institutional NoteWien, Med. Univ., Diss., 2013
Annotation
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Zsfassung in dt. Sprache
Auch erschienen in: J Proteome Res. 2013 Sep 6;12(9):4018-27
LanguageEnglish
Bibl. ReferenceOeBB
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)ABL1 / Tyrosinkinase / DZIP3 / Ubiquitinylierung / Proteinkomplexe
Keywords (EN)ABL1 / tyrosine kinase / DZIP3 / ubiquitination / protein complexes
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-14718 Persistent Identifier (URN)
Restriction-Information
 The work is publicly available
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Functional proteomic and biochemical studies on the ABL1 tyrosine kinase and nuclear multiprotein complexes [10 mb]
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Abstract (German)

ABL1 ist eine Tyrosinkinase, die in Wirbeltierzellen sowohl zytoplasmatisch als auch nukleär lokalisiert ist. Die zytoplasmatische Form von ABL1 reguliert das Zytoskelett, Zellmobilität, Endozytose als auch Zellproliferation. Im Gegensatz dazu steuert die nukleäre Form den Zellzyklus und, als Antwort auf genotoxischen Stress, die gezielte Zelltodinduktion. Die Balance zwischen den verschiedenen ABL1 Funktionen ist sowohl durch Protein-Protein-Interaktionen als auch posttranslationale Modifikationen streng reguliert und in der Literatur sind bereits verschiedene Proteine beschrieben, welche die Aktivität von ABL1 beeinflussen können. In dieser Arbeit zeige ich, dass die E3 Ubiquitin Ligase DZIP3 ein neuer Regulator der nukleären Form von ABl1 ist. DZIP3 ubiquitiniert und interagiert mit ABL1 mittels K63-Ubiquitin-Ketten, die Aktivität der Kinase fördern. Weiterführend ist dieser Ubiquitinierungsschritt für die adäquate Zellantwort auf DNS-Schäden notwendig. Zellen mit fehlender Expression oder einer katalytisch inaktiven Form von DZIP3 sind nicht in der Lage ABL1 zu aktivieren und im Folgenden nicht zur zielgerechten Zelltodinduktion nach DNS-Schädigung fähig. Des Weiteren konnte ich Lysin 438 (K438) als die verantwortliche Ubiquitinierungsstelle in ABL1 identifizieren. Lysin 438 zu Arginin (K438R) Mutanten zeigen reduzierte DZIP3-abhängige Ubiquitinierung und, daraus resultierend, fehlende Kinaseaktivierung in Reaktion auf genotoxische Stimuli.

Darüber hinausreichend habe ich das nukleäre Protein-Protein Interaktionsnetzwerk von ABL1 und der K438R Mutante analysiert. Zur Realisierung bedurfte es zuerst der Etablierung eines robusten und stabilen Protokolls zur Charakterisierung von nukleären Proteinnetzwerken. Ein solches habe ich anhand des Transkriptionsfaktors C/EBPalpha mittels am Carboxy-Terminus lokalisierten STREP-HA Affinität-Tags erstellt. Anhand dieser Vorgehensweise konnte ich anschließend ABL1 Interaktionspartner und Proteinkomplexe identifizieren, sowohl bereits bekannte also auch bisher noch nicht beschriebene. Die nukleäre Form von ABL1 sowie die K438R Mutante interagieren mit den WASF-2 und 14-3-3 Komplexen. Zusätzlich zeigt ABL1 K438R eine starke Assoziation mit Zellzyklus-Regulationsnetzwerken wie beispielsweise dem APC und dem NURD Komplex. In Übereinstimmung mit diesen Resultaten zeigen ABL1 und ABL1 K438R Zellen unterschiedliche Zellzyklusverläufe, wobei die K438R Mutante einen schnelleren G1/S Phasenübergang aufzeigt. Zusammenfassend ist die ABL1 Ubiquitinierung für den Übergang am G1 Kontrollpunkt und das Fortschreiten des Zellzyklus erforderlich.

Abstract (English)

ABL1 is a tyrosine kinase located in both the nucleus and cytoplasm of vertebrate cells. Cytoplasmic ABL1 regulates the remodelling of the cytoskeleton, cellular motility, receptor endocytosis and promotes cell proliferation. On the other hand, nuclear ABL1 has been reported to control the cell cycle and to trigger cell death in response to genotoxic stress. ABL1 activity, which is required to maintain cellular homeostasis, is strongly regulated by protein-protein interactions as well as posttranslational modifications. Different proteins have been shown to control the activation status of this kinase, in both cytoplasm and nucleus. Here, I report the E3 ubiquitin ligase DZIP3 as a new regulator of nuclear ABL1. Specifically, DZIP3 interacted with and ubiquitinated ABL1 in the nucleus, through K63-ubiquitin chains that favour the activation state of the kinase. I propose that the DZIP3-mediated ubiquitination of ABL1 is required for cellular response to DNA damage. Cells deficient for the DZIP3 gene or expressing a catalytically inactive mutant failed to activate ABL1 and to trigger cell death upon genotoxic stress. Furthermore, I have identified ABL1 K438 as the DZIP3-ubiquitination site. Consistently, ABL1 harbouring a K438R mutation displayed reduced DZIP3-mediated ubiquitination and subsequent activation. Additionally, ABL1 K438R was not activated by genotoxic stress and cells expressing this mutant showed an impaired response to DNA damage. I have analysed the nuclear interactome of ABL1 and ABL1 K438R by affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS). For this purpose, I have firstly established a robust and straight forward strategy to correctly characterize nuclear protein interactomes, using the transcription factor C/EBPalpha with a STREP-HA tag at its carboxyl terminus as a model for our approach. Following the same AP-MS approach, I identified several known as well as undescribed ABL1 interactors and protein complexes. Nuclear ABL1 associated with the WASF-2 and the 14-3-3 protein complexes and the same was true for ABL1 K438R. In addition, ABL1 K438R showed a strong association with protein complexes involved in the cell cycle regulation, such as the APC and the NURD complexes. In line with these data, cells expressing either ABL1 or ABL1 K438R showed a different cell cycle progression. ABL1-expressing cells were progressing through the G1/S phase transition faster than cells expressing the K438R mutant. Overall, ABL1 ubiquitination was required to license the G1-checkpoint and promote cell cycle progression.

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