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Bibliographic Metadata

Title
Structural implications of the two centriolar proteins, ZYG-1 and SAS-5, in centriole formation / submitted by Ekaterina Shimanovskaya
Additional Titles
Strukturelle Auswirkungen der zwei zentriolaren Proteine ZYG-1 und SAS-5 auf die Entwicklung von Zentriolen
AuthorShimanovskaya, Ekaterina
CensorDong, Gang
Published2014
Description92 S. : Ill., graph. Darst.
Institutional NoteWien, Med. Univ., Diss., 2014
Annotation
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Zsfassung in dt. Sprache
LanguageEnglish
Bibl. ReferenceOeBB
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)Zentriolen / ZYG-1 / SAS-5 / polo-like Kinase 4
Keywords (EN)Centrioles / ZYG-1 / SAS-5 / polo-like kinase 4
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-14741 Persistent Identifier (URN)
Restriction-Information
 The work is publicly available
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Structural implications of the two centriolar proteins, ZYG-1 and SAS-5, in centriole formation [19.53 mb]
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Classification
Abstract (German)

Zentriolen kommen in allen tierischen Zellen vor und spielen eine wichtige Rolle in der Organisation mitotischer Spindeln und in der Entstehung von Zilien. Eine Untergruppe von Kern zentriolaren Proteinen wurde in C. elegans identifiziert und ihre hirarchische Eingliederung in entstehenden Zentriolen wurde etabliert. Wärend der Zentriolen Bildung werden SPD-2 und ZYG-1 Proteine als erstes zu Mutter Zentriolen geführt, mit anschließender Rekrutierung von SAS-5 und SAS-6, zweier coiled-coil Proteine. Die anschließende Rekrutierung von SAS-4 ermöglicht schließlich den Anschluß von 9 Mikrotubuli, um eine Tochter Zentriole entstehen zu lassen. Both ZYG-1 and SAS-5 are the key regulators in centriole assembly. ZYG-1 ist das funktionale Ortholog von Ser/Thr polo-like Kinase 4 (Plk4) in C.elegans. Interessanterweise unterscheidet sich Plk4 in dieser Hinsicht von anderen Mitgliedern der Plk-Familie (Plk1, -2, -3), da es statt den üblichen Tandem Polo-Boxen eine zentrale cryptic Polo-Box (CBP) und eine C-terminale PB besitzt. Bioinformatische Analysen deuten darauf hin, dass ZYG-1 ebenso aus einer N-terminalen katalytischen Domäne, einer zentralen CPB und einer globulären C-terminalen Domäne besteht. Letztere ähnelt in ihrer Sekundärstruktur der konventionellen PB. SAS-5 hat keine eindeutigen Homologe in anderen Spezies. Es ist bekannt, dass SAS-5 eine lange N-terminale globulare Domaine (NTD) enthält, gefolgt von einer random coil Domaine am C-terminus. Zur Zeit gibt es noch keinen Beweis einer direkten strukturellen Beziehung zwischen ZYG-1 und Plk4. Ebenso unbekannt ist der genaue Mechanismus wie ZYG-1 und/oder Plk4 an die Zentriolen lokalisieren. Darüber hinaus ist die Rolle der SAS-5 NTD in der Zenriolen Zusammenfügung noch unbekannt. Um den molekularen Aufbau und infolgedessen die Funktionen von ZYG-1 und SAS-5 besser zu verstehen haben wir Röntgenkristallography, NMR-Spektroskopie, Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS) und diverse biochemische Methoden verwendet. Wir haben verschiedene Konstrukte von ZYG-1 und SAS-5 in E. coli exprimiert und aufgereinigt und konnte schlussendlich die Kristallstruktur der CBP von ZYG-1 und NTD von SAS-5 lösen. Wir ermittelten die Kristallstruktur von ZYG-1 CPB und konnten mithilfe von SAXS Messungen feststellen, dass es in wässriger Lösung als Z-förmiges Dimer vorliegt. Basierend auf unsere SAXS Daten konnten wir weiters aufzeigen, dass der N-terminus von SAS-5 ein stabiles Tetramer bildet. Zur selben Zeit wurde die Struktur von D. melanogaster Plk-4 CPB publiziert. Wir konnten herausfinden, dass beide Proteine eine nahezu identische Tertiär- und Sekundärstruktur aufweisen, obwohl nur eine geringe Sequenz-Übereinstimmung vorliegt. Das ist der erste strukturelle Hinweis, dass die ZYG-1 Kinase aus Nematoden der Plk4 Familie angehört. Darüber hinaus konnten wir sowohl bei ZYG-1 CPB als auch bei Plk-4 CBP einen konservierten basischen Bereich identifizieren, der spezifisch an die saure N-terminale Domäne von SPD-2 und Asterless bindet. Diese Ergebnisse zeigen einen konservierten Mechanismus, der das andocken von ZYG-1/Plk4 an Prozentriolen gewährleistet. Interessanterweise, konnten wir feststellen, dass nur die CPB, nicht aber die C-terminale PB von ZYG-1 dimerisiert, was in Kontrast zur veröffentlichten dimeren Struktur der C-terminalen PB von M. musculus Plk-4 steht. Es liegt also nahe, dass die C-terminale PB von ZYG-1 möglicherweise eine einzigartige monomerische PB ist, die noch nicht charakterisiert wurde. Weiters zeigen sowohl SAXS als auch 2-D NMR Experimente, dass die C-terminale PB von ZYG-1 gefalten ist und mit der CPB durch einen 60-aa langen, unstrukturierten Linker verbunden ist. Zukünftige Studien am vollständigen ZYG-1 Protein werden nötig sein, um die molekularen und mechanistischen Details der Funktion dieser beiden

Abstract (English)

Centrioles are present in all animal cells and play dual roles in organizing mitotic spindles and nucleating cilia. A subset of core centriolar proteins has been identified in C. elegans, and their hierarchical incorporations into nascent centrioles have been established. During centriole assembly, SPD-2 and ZYG-1 proteins are first recruited to mother centrioles, which is followed by the recruitment of two coiled-coil proteins SAS-5 and SAS-6. Subsequent recruitment of SAS-4 allows the attachment of the 9 microtubules to generate a daughter centriole. Both ZYG-1 and SAS-5 are the key regulators in centriole assembly. ZYG-1 is a functional orthologue of the Ser/Thr protein polo-like kinase 4 (Plk4). Plk4 differs from other Plk family members - Plks 1, 2, 3 - by containing a central cryptic polo-box domain (CPB) and a C-terminal PB instead of two tandem canonical PBs. SAS-5 has no clear homologues in other species. It is predicted to contain a large N-terminal globular domain (NTD) followed by a random coil at its C-terminus. By now, there is neither direct evidence showing that ZYG-1 to Plk4 are structurally identical nor structural data describing the molecular mechanism underlying centriolar docking of ZYG-1. Moreover, the role of the SAS-5 NTD in centriole assembly remains unknown. To illuminate the molecular architecture of ZYG-1 and SAS-5 and to shed light on its functional application, we have used X-ray crystallography, nuclear magnetic resonance (NMR) spectrometry, small-angle X-ray scattering (SAXS) and multiple other biochemical techniques. We have managed to overexpress and purify from E. coli several different truncations of ZYG-1 and SAS-5. To the end, we have determined the crystal structure of the ZYG-1 CPB and further identified by SAXS a Z-shaped dimer that forms in aqueous solution. Also we reveal that the N-terminus of SAS-5 forms a stable tetramer based on our SAXS data. ^During this time, a structure of the D. melanogaster Plk4 CPB was published. Interestingly, we found that, despite their low sequence identity (17%), both proteins possess almost an identical tertiary structure. This is the first structural evidence that directly relates nematode ZYG-1 to the Plk4 kinase family. Furthermore, we have identified a highly conserved basic patch on both ZYG-1 and Plk4 CPBs that specifically binds the SPD-2 and asterless N-terminal acidic region (AR), respectively. These findings reveal a conserved mechanism ensuring the docking of ZYG-1/Plk4 to procentrioles. Interestingly, we have further found that only the CPB of ZYG-1 dimerizes while the C-terminal PB does not, which is in contrast to the reported dimeric crystal structure of the M. musculus Plk4 C-terminal PB. It suggests that the C-terminal PB of ZYG-1 may be a unique monomeric PB that has not been characterized. Additionally, both SAXS and preliminary 2-D NMR analysis suggest that the C-terminal PB of ZYG-1 is well folded and linked to the CPB by a 60- aa long unstructured linker. Future studies using the full-length ZYG-1 protein will be necessary to further disclose a molecular and mechanistic picture of ZYG-1/Plk4 functionality during the centriole assembly.

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