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Bibliographic Metadata

Title
Molecular mechanisms of inflammation and neurodegeneration in multiple sclerosis / submitted by Isabella Wimmer
Additional Titles
Molekulare Mechanismen von Entzündung und Neurodegeneration in Multipler Sklerose
AuthorWimmer, Isabella
CensorLassmann, Hans
Published2014
DescriptionXIII, 196 S. : Ill., graph. Darst.
Institutional NoteWien, Med. Univ., Diss., 2014
LanguageEnglish
Bibl. ReferenceOeBB
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)Multiple Sklerose / Oxidativer Schaden / Mitochondrien / Neurodegeneration / p22phox / Eisen / oxidierte Phospholipide / Bluthirnschranke / PECAM-1 / PODXL
Keywords (EN)multiple sclerosis / oxidative damage / mitochondria / neurodegeneration / p22phox / iron / oxidized phospholipids / blood-brain barrier / PECAM-1 / PODXL
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-14779 Persistent Identifier (URN)
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Molecular mechanisms of inflammation and neurodegeneration in multiple sclerosis [22.39 mb]
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Abstract (German)

Multiple Sklerose (MS) ist eine chronisch-entzündliche Erkrankung des Zentralnervensystems, in der es auf Grund von akuter oder chronischer Entmarkung der Nervenfasern zu einem schubförmig remittierenden oder progredient fortschreitenden Krankheitsverlauf kommt. MS ist die häufigste neurologische Erkrankung im jungen Erwachsenenalter. Obwohl MS lange Zeit als eine Krankheit der weißen Substanz von Gehirn und Rückenmark galt, konnten in den letzten Jahrzehnten Entmarkungsherde auch in der kortikalen und tiefen grauen Substanz nachgewiesen werden. Weiters wurden in den vergangen Jahren oxidativer Stress und mitochondrialer Schaden als wichtige Mechanismen in der MS Pathogenese beschrieben. Diese Doktorarbeit befasst sich mit der Analyse von essentiellen Schritten in der Entstehung und Ausbreitung von oxidativem Gewebeschaden mittels Analyse von Genchips und Immunhistochemie.^ Zusätzlich beinhaltet sie eine funktionelle in-vitro-Studie über die Rolle zweier Moleküle, PECAM-1 und Podocalyxin (PODXL), in der Wanderung von Leukozyten über die Bluthirnschranke.<br />In einem ersten Schritt etablierten wir die Extraktion von hochqualitativer mRNA aus Autopsiegewebe von MS-Patienten und Kontrollfällen, welches routinemäßig in Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet wurde. Mittels Genchip-Analysen konnten wir die Genexpression in verschiedenen Regionen rund um und in Entmarkungsherden der weißen Substanz von MS-Patienten mit unbeeinträchtigter weißer Substanz von Kontrollfällen vergleichen. Weiters war es uns möglich, die Genexpression in aktiven Läsionen der kortikalen grauen Substanz im Vergleich mit kortikalen Bereichen von gesunden Kontrollen sowie von Patienten mit neurodegenerativer (Morbus Alzheimer) oder entzündlicher (tuberkulöse Meningitis) Krankheit zu analysieren.^ Um die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen auch in Tiermodellen für MS untersuchen zu können, erweiterten wir unsere Genexpressionsstudie mit Daten über das meistangewandte Modell: EAE (experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis).<br />Im Vergleich mit allen untersuchten gesunden und erkrankten Kontrollfällen konnten wir die ausgedehnte subpiale Entmarkung in der kortikalen grauen Substanz von MS-Patienten als krankheitsspezifisches Entmarkungsmuster detektieren. Mittels Genchip-Analysen und Immunhistochemie identifizierten wir die Erzeugung von Radikalen durch NADPH-Oxidasen als treibenden Pathomechanismus in MS und EAE. Den in der Literatur beschriebenen Einfluss von iNOS in MS konnten wir nicht bestätigen. Die Expression von mitochondrial kodierten Genen war in EAE-Gewebe kaum verändert, während eine stark verringerte Expression in Entmarkungsherden der weißen Substanz bzw. ein verstärkte Expression in kortikalen Läsionen ersichtlich war.^ Diese gegensätzlichen Ergebnisse gründen vermutlich auf der unterschiedlichen Ausprägung von pathologischen Prozessen (Entmarkung, Neurodegeneration, usw.) in weißer und grauer Substanz. Auch die Expression von Genen, die für Eisenhomeostase-regulierende Proteine kodieren, war in EAE-Gewebe und MS-Gewebe unterschiedlich ausgeprägt. Mittels Antikörperfärbung gegen oxidierte Phospholipide fanden wir in MS-Läsionen eine oxidative Schädigung von Nervenzellen und Oligodendrozyten, während wir in der EAE keinen Hinweis auf oxidativen Gewebeschaden sehen konnten. Mittels Lebendzellmikroskopie zeigten wir eine veränderte Wanderungsroute von T-Lymphozyten über PECAM-1-defiziente Endothelzellen. Preliminäre Untersuchungen zur Funktion von PODXL-Expression in Endothelzellen der Bluthirnschranke zeigten eine anti-adhäsive Wirkung des Proteins.

Abstract (English)

Multiple sclerosis (MS) is a chronic demyelinating inflammatory disease of the central nervous system. It is the most common neurological disorder among young adults and follows a heterogeneous disease course. Traditionally, MS has been regarded as a white matter disease. This concept has, however, been challenged since substantial cortical gray matter and deep gray matter involvement was evidenced as well. More recently, pathogenic mechanisms such as oxidative stress and mitochondrial damage have gained importance in MS research. In this thesis, we aimed at analyzing key steps in the generation and enhancement of oxidative tissue injury via gene expression profiling and immunohistochemistry.^ Additionally, we studied the role of two blood-brain barrier (BBB) molecules, PECAM-1 and podocalyxin (PODXL), in leukocyte trafficking across the BBB.<br />In order to enable whole-genome microarray analyses of MS and control tissue, we established and validated a comprehensive protocol for the isolation of high-quality mRNA from well-characterized formalin-fixed paraffin-embedded autopsy MS and control tissue. With the resulting microarray data sets at our hands, we compared gene expression in different developmental stages of white matter lesions (periplaque white matter, initial (pre-phagocytic) lesions, and active demyelinating lesions) with normal white matter from healthy controls. Additionally, transcriptional changes in active cortical MS lesions in comparison with healthy controls, and, furthermore, also inflammatory (tuberculous meningitis) and neurodegenerative (Alzheimer's disease) controls were analyzed.^ For a direct comparison of disease-driving molecular mechanisms between the human disease and its well-known animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), tissue from passive MBP EAE-afflicted rats was harvested and qPCR analyses were performed.<br />In comparison with healthy, inflammatory, and neurodegenerative controls, we observed that the widespread subpial primary demyelination in MS cortices was highly specific for the disease and was not detected in any other studied disorder. Regarding disease-driving molecular mechanisms, we identified and validated nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidases as key enzymes in radical production in MS lesions and in EAE tissue, while we could not confirm the contribution of inducible nitric oxide synthase (iNOS) to MS pathology.^ Changes in mitochondrially-encoded gene expression were subtle in EAE, whereas a strong downregulation or upregulation was apparent in white matter or cortical MS lesions, respectively. The differences between white matter and cortical MS lesions most likely reflected the varying speed and aggressiveness of the disease processes, such as active demyelination and neurodegeneration, in these areas.<br />Different expression profiles of genes involved in iron metabolism were detectable in EAE, white matter MS lesions, and also cortical MS lesions. Generally, oxidative injury-mediated tissue damage, visualized by immunoreactivity for oxidized phospholipids, in neurons and oligodendrocytes was pronounced in MS lesions, while, despite high levels of inflammation, no signs of oxidatively-damaged phospholipids were found in experimental animal tissue.^ Via in vitro live cell imaging under flow conditions, we showed that PECAM-1 deficiency in BBB endothelial cells might change the route of T cell transmigration (diapedesis) across endothelial cell monolayers, while T cell adherence, crawling, or the frequency of diapedesis were not significantly altered.<br />Preliminary studies after Podxl shRNA knock-down in the endothelioma cell line bEnd5 pointed towards an anti-adhesive function of the protein.

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