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Titelaufnahme

Titel
Structural studies of the transport cycle of the ABC transporter ABCB1 / submitted by Yaprak Dönmez Cakil
Weitere Titel
Strukturelle Untersuchungen des Transportzykluses des ABC Transporters ABCB1
Verfasser / VerfasserinDönmez Cakil, Yaprak
Begutachter / BegutachterinThomas Stockner
Erschienen2015
UmfangXVII, 115 Bl.
HochschulschriftWien, Med. Univ., Diss., 2015
Anmerkung
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Zsfassung in dt. Sprache
SpracheEnglisch
Bibl. ReferenzOeBB
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)ABC Transporter / P-Glykoprotein / Substratbindung / Cystein-Disulfidbrücken / Transportzyklus / Nukleotidbindungsstelle
Schlagwörter (EN)ABC transporter / P-glycoprotein / drug binding / cysteine cross-linking / transport cycle / nucleotide binding site
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-14823 Persistent Identifier (URN)
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Structural studies of the transport cycle of the ABC transporter ABCB1 [16.49 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Der multispezifische Efflux-Transporter P-Glykoprotein (P-gp, ABCB1) ist ein Mitglied der ABC Transporter-Superfamilie. P-gp spielt eine wichtige Rolle in der Arzneimitteldisposition und Arzneistoffresistenz. Ein besseres Verständnis der Struktur und Funktion ist deshalb wichtig für die Entwicklung neuartiger Therapeutika. Die zwei Transmembrandomänen des P-gp bilden Translokationspfade an ihrer Grenzfläche, die den Transport strukturell unterschiedlicher Verbindungen durch die Plasmamembran ermöglichen. Die Pseudosymmetrie des Transporters impliziert die Existenz zweier Bindungsmodi. Substanzen bevorzugen in der Regel einen der beiden. Wir identifizierten zwei konservierte Tyrosinreste, Y950 und Y953, in dem von Propafenonen bevorzugten Translokationspfad. Bekannterweise sind Tyrosinreste essentiell für die molekulare Erkennung in biologischen Systemen.^ Das erste Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der Hydroxylgruppen der beiden Tyrosine zur Bildung von Wasserstoffbrücken mit Rhodamin 123 (Rh123) und Propafenonen zu untersuchen. Wir konnten zeigen, dass die Tyrosine Y950 und Y953 Wasserstoffbrückenbindungen mit Rh123 beziehungsweise mit Propafenonen bilden. Darüber hinaus konnten wir die Existenz der eingangs erwähnten Bindungsmodi bestätigen. Die zweite Fragestellung betraf Konformationsänderungen des Proteins, die für die Erreichung der auswärts-gerichteten Konformation erforderlich sind.

Dafür lieferte die Kristallstruktur von Sav1866 einen idealen Ausgangspunkt. Die Kristallstruktur zeigt auf der extrazellulären Seite des Proteins eine Auftrennung in zwei helikale Bündel, die flügelartige Ausläufer des Transporters bilden.^ Mutation von Resten in Helices 6 und 12 auf der extrazellulären Seite des Proteins zu Cysteinen erlaubte, die Flexibilität dieser flügelartigen Ausläufer des Proteins in einer Membranumgebung zu studieren und zu untersuchen, wie nahe sie sich kommen können. Eine spontane Bildung von Cystein-Disulfidbrücken konnte gezeigt werden, die durch die Gegenwart von Cu-ionen als Oxidans zur Vollständigkeit getrieben werden konnten. Die Anwesenheit von Nukleotiden veränderte den Anteil des cross-gelinkten Transporters nicht. Dies wurde als Evidenz gewertet, dass eine Aposition der NBD Domänen nicht mit einer kompletten Annäherung der flügelartigen Ausläufer im Widerspruch steht.^ Das dritte und letzte Ziel dieser Arbeit war es, ein besseres Verständnis des Katalysezyklus von ABC-Transportern mit einer nicht-kanonischen Nukleotidbindungsstelle (NBS) zu bekommen.

Im P-gp sind beide Nukleotidbindungsstellen aktiv, während es im Gallensalz-Exporter (BSEP) vier nicht-kanonische Substitutionen in einer der beiden Nukleotidbindungsstellen gibt (NBS 1). Eine Substitution betrifft den katalytischen Glutamatrest, der in BSEP durch ein Methionin ersetzt ist. Durch den Ersatz des katalytischen Glutamatrestes in NBS1 des P-gp durch Methionin erhält man einen nicht funktionellen Transporter. Eine gleichzeitige Substitution aller vier Reste kann die Transportfunktion von P-gp nicht wiederherstellen. Allerdings beobachteten wir in Gegenwart des bekannten Modulators Tariquidar eine erhöhte Reaktivität mit dem konformationssensitiven Antikörper UIC2, die in der Mutante, die das katalytische Glutamat nicht enthält, nicht beobachtet werden konnte.^ Wir schlagen vor, dass die zusätzlichen Mutationen die Energiebarriere der NBS1 herabsetzen und damit eine teilweise Wiederherstellung der Substratbindungsfähigkeit einhergeht.

Unsere Daten sind ein Beitrag zur weiterführenden Charakterisierung von ABC-Transportern auf molekularer Ebene und unterstützen dadurch den Prozess der Arzneimittelentwicklung.

Zusammenfassung (Englisch)

The multispecific drug efflux transporter P-glycoprotein (P-gp, ABCB1) is a member of the ATP binding cassette (ABC) transporter superfamily. P-gp plays an important role in drug disposition and resistance, therefore a deeper understanding of its structure and function is essential for development of novel therapeutics. Its two transmembrane domains form composite solute translocation paths, which allow for movement of structurally diverse compounds across the plasma membrane. The rotational pseudo-symmetry of the transporter implies the existence of two binding modes. Solutes typically prefer one of them. We identified two conserved tyrosine residues Y950 and Y953 in the preferred translocation path for propafenone type ligands and studied their contribution to ligand interaction. Tyrosine residues are known to be essential for molecular recognition in many biological systems.^ The first aim of this thesis was to assess the role of tyrosyl hydroxyl groups to hydrogen bond formation with rhodamine 123 (rh123) and propafenones. We demonstrated the active site tyrosines Y950 and Y953 as direct hydrogen bonding partners of both rh123 and propafenone type ligands. Moreover, we confirmed the previously reported dual substrate binding mode of P-gp. The second aim addressed the importance of conformational changes of the protein for achieving an outward facing substrate releasing state. For this aim the Sav1866 crystal structure, which shows wing-like extensions on the extracellular side, was an ideal starting structure. Wing formation corresponds to a possible movement of helices within the membrane spanning helical bundles, the extent of which was explored in a physiological membrane environment by introduction of cross-linkable cysteine residues in the extracellular portion of P-gp.^ We demonstrated spontaneous formation of cross-links at zero length and further confirmed that TM helices 6 and 12 can come in close proximity at their extracellular ends using MTS cross-linkers of different lengths. Nucleotide binding did not prevent formation of zero-length cross-links. We also demonstrated a requirement of residues I328 and F971 for protein mechanics. The third and final aim was to provide insights into the catalytic cycle of ABC transporters with one non-canonical nucleotide binding site (NBS). Both NBSs are active in P-gp, while the bile salt export pump (BSEP) has four non-canonical substitutions in NBS1. One of these is the catalytic glutamate residue which is replaced by methionine. When introduced to P-gp, methionine at this position yielded a non-functional transporter that was also found to show weak UIC2 probed conformational changes in the presence of substrates.^ Simultaneous mutation of the additional three residues that differ at the NBD/NBD interface to those found in BSEP did not rescue P-gp transport function. However, we found recurrence of conformational changes in the presence of the well-known modulator tariquidar. We posit that these additional mutations lower the energy barrier of NBS1 and consequently lead to partial regain in function. P-gp and BSEP may differ in the mechanism by which ATP binding and hydrolysis are coupled to drug transport; the NBD:NBD interface, however, may be expected to have a strong influence on substrate dependent conformational changes.

Neverthless, it is not the sole determinant for function. Overall, these data contribute to further define P-gp solute interactions in the drug binding cavity, as well as conformational changes, which are associated with the P-gp transport cycle.^ Data thus resulted in an improved characterization of model ABC transporters of the ABCB subfamily at a molecular level and results are expected to aid in drug development process.

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