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Bibliographic Metadata

Title
Purification of plasma derived human complement Factor H for large scale manufacturing and characterisation / submitted by Ruth Madlener
Additional Titles
Entwicklung eines Aufreinigungschemas, geeignet für die großtechnische Anwendung, und Characterisierung des humanen Komplement Faktor H Proteins aus Plasmafraktionen
AuthorMadlener, Ruth
CensorJilma, Bernd
Published2013
Description240 S. : Ill., graph. Darst.
Institutional NoteWien, Med. Univ., Diss., 2013
Annotation
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Zsfassung in dt. Sprache
LanguageEnglish
Bibl. ReferenceOeBB
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)Komplementsystem / Faktor H / Plasma Fraktionierung / Chromatographie / Virussicherheit
Keywords (EN)Complement system / Factor H / Plasma fractionation / chromatography / virus inactivation
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-16464 Persistent Identifier (URN)
Restriction-Information
 The work is publicly available
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Purification of plasma derived human complement Factor H for large scale manufacturing and characterisation [4.55 mb]
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Classification
Abstract (German)

Der humane Komplementfaktor H, bestehend aus 20 komplementkontrollierenden Modulen, reguliert Komplementaktivierung mittels Inhibierung. In kürzlich erschienenen Studien wurden eine insuffiziente Expression oder polymorphe Varianten dieses Proteins mit verschiedenen Krankheiten wie z.B. der Augenkrankheit „Altersbedingte Makuladegeneration“ (AMD) oder dem atypischen „Hämolytisch-urämischen Syndrom“ (aHUS) assoziiert. AMD ist die Hauptursache für Erblindung in der kaukasischen Bevölkerung und ist derzeit nicht zufriedenstellend behandelbar. Eine Verabreichung von Faktor H kann auf die therapeutischen Eigenschaften geprüft werden, allerdings ist hierfür die Entwicklung eines leicht skalierbaren Aufreinigungsschemas notwendig. Methoden: Deshalb wurde ein Verfahren zur Reinigung von humanem Faktor H skalierbar auf den Produktionsmaßstab entwickelt. In einem ersten Schritt konnten die Ethanol Fraktionen des humanen Plasma-Fraktionierungsschemas nach Cohn mittels etablierter Testsysteme auf deren Faktor H Gehalt untersucht werden. Die ersten Prozessschritte inkludierten nicht nur Filtrationsmethoden, sondern auch Reduzierungsschritte spezifisch für proteolytische Verunreinigungen, die andernfalls zu einer reduktiven Spaltung des Zielproteins führen würden. Weiteres musste mindestens ein Virusinaktivierungsschritt in das Prozessschema inkludiert werden, zahlreiche chromatographische Matrizes wurden mittels Design of Experiment evaluiert. Das resultierende Reinigungsschema wurde dahingehend optimiert eine zureichende Extraktion des Zielproteins aus dem Startmaterial zu garantieren. Weiteres wurde durch die Filtration gefolgt von einer Erhitzung der resultierenden Lösung eine Abreicherung der proteolytischen Aktivitäten sowie eine Inaktivierung von Viren erzielt. Eine Ultra- und Diafiltration ermöglichte die Lösung in ein adäquates Puffersystem für die Säulenbeladung überzuführen und eine Proteinkonzentration geeignet für eine Solvent Detergent Behandlung, eine potente Virusinaktivierungsmethode für Lipid-umhüllte Viren, zu erhalten. Der chromatographische Prozess inkludierte eine Anionenaustauschchromatographie Matrix gefolgt von einer Affinitätsmatrix sowie einer mixed-mode Chromatographie. Das resultierende Produkt wurde in verschiedenen Formulierungspuffern formuliert und charakterisiert. Resulate: Der Filterkuchen nach II+III Pastensuspension und Filtration - unter Verwendung von Filterhilfsmitteln gelöst - illustrierte das Startmaterial mit der höchsten Faktor H Konzentration (80-90 %). Diese Fraktion ist ein Abfallprodukt des Immunglobulin Prozessverfahrens der Baxter Inc. Der Filtrationsschritt reduziert nicht nur proteolytische Verunreinigungen, sondern dient auch der Virusabreicherung für Immunglobulin. Deshalb war die Implementierung einer Hitzebehandlung zur Reduktion dieser sehr entscheidend. Eine optimale Kombination von chromatographischen Medien (Anionenaustausch Chromatographie gefolgt von einer Affinitätsmatrix and einer mixed-mode Matrix) führte zum Erhalt eines Produktes von hoher Reinheit und Aktivität. Als zweitmögliches Startmaterial wurde der Fraktion I Niederschlag identifiziert. Dieses Startmaterial zeigte einen deutlich geringeren Gehalt an amidolytischen Aktivitäten, allerdings enthält dieses nur 10 20 % des gesamten Faktor H. Deshalb wurde für das zweite Startmaterial ein bisher nur sehr präliminärer Prozess entwickelt. Schlussfolgerung: Das etablierte Verfahrensschema zur humanen Komplement Faktor H Proteinaufreinigung illustriert einen ökonomischen Prozess geeignet für den Großindustrie Produktionsmaßstab. Dadurch können große Mengen an Endprodukten aus einer Abfallfraktion des Ethanol-Fraktionierungsprozesses nach Cohn verwendet als Startmaterial, zur Therapie von z.B. AMD oder aHUS, erhalten werden.

Abstract (English)

The human complement Factor H regulates complement activation by inhibition. It is a glycoprotein consisting of 20 complement control protein (CPP) modules. Recently insufficient expression or polymorphic variants of this protein had been associated with various diseases like the eye disease age-related macular degeneration (AMD) or atypical hemolytic uremic syndrome (aHUS). AMD is a major socioeconomic burden and cannot be treated to a sufficient extend. Therefore new therapeutic agents like Factor H have to be investigated on their therapeutic capacities and as consequence have to be purified in purification schemes which are easily scalable. Methods: A purification process for Factor H out of human plasma which is suitable for large-scale manufacturing was established. In a first step intermediates of the cold ethanol fractionation, a well known large-scale process for human plasma fractionation established first by Cohn and colleagues in the 1940s, were tested on their Factor H content by established Factor H quantification methods. The challenge of the first crude purification steps before column chromatography was not only to clarify the suspension for column chromatography but also to reduce amidolytic/proteolytic impurities to prevent Factor H from cleavage and to implement at least one virus inactivation step. Various chromatographic resins had been screened and evaluated for resolution and efficiency. The resulting preliminary purification scheme was optimized to guarantee an optimal extraction of the protein out of the starting material followed by a clarification step and heat treatment to reduce amidolytic impurities and inactivate viruses. Ultrafiltration and diafiltration were applied to exchange buffers for column loading. Before column loading this concentrated solution was treated with Solvent Detergent (SD), a potent virus inactivation for lipid enveloped viruses, as a second virus inactivation step. The column chromatography process comprises anion exchange followed by an affinity resin and a novel mixed-mode chromatography. The resulting product was formulated in various formulation buffers and then characterized. Results: The starting material comprising the highest Factor H amount (80-90%) was found to be the filter cake after II+III paste suspension filtration in the presence of filter aids, a waste fraction of the immunoglobulin manufacturing process from Baxter Inc. This filtration step is known to reduce significantly amidolytic activities and to separate viruses from the immunoglobulin. Therefore heat treatment was implemented to reduce amidolytic impurities and to act as virus inactivation step. An optimal combination of chromatographic resins using optimized buffer systems was established (anion exchange followed by affinity and mixed-mode and size-exclusion chromatography) to result in a final container with high purity and activity. A second possible starting material from the fractionation process was evaluated. This material contains less amidolytic impurities. However, it only contains 10-20% of total Factor H. Therefore only a very preliminary process scheme was established for the second possible starting material. Conclusion: The established human complement Factor H purification process is economical and suitable for large scale manufacturing. It results in the production of large quantities of this protein using waste fractions of the cold ethanol fractionation process as starting materials. The purified Factor H might be used for the treatment of e.g. AMD or aHUS.

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