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Bibliographic Metadata

Title
New possibilities for the analysis of short-lived protein-protein interactions: identification of PP2A-Cdc55's substrates and analysis of the PP2A-biogenesis with M-Track / submitted by Thomas Kupka
AuthorKupka, Thomas
CensorOgris, Egon
Published2015
Description210 S. : graph. Darst.
Institutional NoteWien, Med. Univ., Diss., 2015
LanguageEnglish
Bibl. ReferenceOeBB
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)M-Track / PP2A / Protein-Protein-Interaktionen / Methode / Transient / kurzlebig / Phosphatase / Phosphorylierung
Keywords (EN)M-Track / PP2A / Protein-Protein-Interactions / Method / Transient / short-lived / Phosphatase / Phosphorylation
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-16473 Persistent Identifier (URN)
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 The work is publicly available
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New possibilities for the analysis of short-lived protein-protein interactions: identification of PP2A-Cdc55's substrates and analysis of the PP2A-biogenesis with M-Track [7.66 mb]
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Abstract (German)

Interaktionen zwischen Proteinen sind ein fundamentaler Bestandteil beinahe aller zellulären Prozesse. In den letzten Jahrzehnten gab es große Bemühungen diese Interaktionen mit Hilfe verschiedenster Methoden nachzuweisen und zu untersuchen. Trotz des großen Aufwands der dabei betrieben wurde, erweist sich die Detektion von transienten kurzlebigen Interaktionen noch immer als äußerst schwierig. Ein Paradebeispiel, bei dem die Schwierigkeit diese transienten kurzlebigen Interaktionen nachzuweisen ein grundlegendes Hindernis zu einem besseren Verständnis der biologischen Prozesse darstellt, findet sich in der phospho-Ser/Thr-Phosphatase PP2A. Da die Interaktionen, die PP2A mit den meisten seiner Substrate eingeht, transient und kurzlebig sind, entziehen sie sich einer Detektion durch die etablierten Methoden und sind zum Großteil immer noch unbekannt. Zur Lösung dieses Problem haben wir M-Track entwickelt, ein neuartiges 2-hybrid-System, in dem ein Enzym-Substrat-Paar zur Detektion von Protein-Protein-Interaktionen verwendet wird. Das Detektions-Paar besteht aus der katalytischen Domäne einer hyperaktiven Mutante der humanen Methyltransferase Suvar39H1 (HKMT) und dessen Substrat, den 22 N-terminalen Aminosäuren des Histons H3 (H3-tag). Die HKMT wird an das eine der potentiell miteinander interagierenden Partner fusioniert (Bait) und das H3-tag an den anderen (Prey). Sollten Bait und Prey durch eine Interaktion in unmittelbare Nähe zueinander kommen, erfolgt eine HKMT-vermittelte Trimethylierung des H3-tags, die in der Folge, z.B. mit Hilfe einer Western-blot Analyse, als Read-out für die erfolgte Interaktion genutzt werden kann. Am Beispiel der vermuteten Interaktion zwischen PP2A-Cdc55 und seinem Substrat Net1, die von den bisher etablierten Methoden noch nicht nachgewiesen werden konnte, haben wir M-Tracks Fähigkeit zum Nachweis solcher transienter kurzlebiger Interaktionen erfolgreich belegen können. Außerdem konnten wir aufzeigen, wie M-Track genutzt werden kann um weitere potentielle Substrate zu verifizieren. Die in einem M-Track Assay generierte Methylierung ist dauerhaft und kann daher auch dazu genutzt werden, die Populationen der Prey-Moleküle zu unterscheiden, die schon oder noch nicht mit dem Bait-Partner interagiert haben. Indem man nun die Preys mit methyliertem H3-tag von denen mit nicht-methyliertem trennt, kann man die spezifischen biochemischen Eigenschaften dieser zwei Spezies untersuchen. Mit Hilfe dieser Vorgehensweise konnten wir Einblicke in den zeitlichen Ablauf der PP2A-Biogenese gewinnen, sowie den aktivierenden Einfluss der Interaktion des Chaperones Rrd2 auf die katalytische Untereinheit von PP2A in vivo aufzeigen. M-Track ist eine effektive und effiziente Methode zum Nachweis von Protein-Protein Interaktionen in Hefe. Es bietet die Möglichkeit direkte von indirekten Interaktionen zu unterscheiden und kann ohne großen Aufwand in den meisten Laboren Anwendung finden. Durch die Verbindung von M-Track Assays mit anschließender Immunoprezipitation der methylierten und nicht-methylierten Prey-Moleküle, kann es dabei helfen den zeitlichen Ablauf in Signalwegen, sowie die Auswirkung der Interaktion des jeweiligen Bait-Partners auf die biochemischen Eigenschaften des Preys zu untersuchen.

Abstract (English)

Interactions between proteins constitute the basis of practically every cellular process and over the last decades a lot of effort has been taken in studying them by applying various kinds of methods. Despite the work which has gone into the optimization of protein-protein interaction analysis, the detection of transient short-lived interactions still represents a major challenge for the established approaches. A prime example where this difficulty poses an obstacle to a better understanding of underlying mechanisms is the phospho-Ser/Thr-phosphatase PP2A. Because PP2A interacts with the majority of its substrates in a transient and short-lived manner most of these interactions escape detection by established methods and thus the majority of PP2As substrates are still unknown. To overcome this obstacle, we developed M-Track, a novel 2-hybrid-like system in which an enzyme-substrate pair is employed for the detection of protein-protein interactions. The detection pair consists of the catalytic domain of a hyperactive mutant of the human histone H3 methyltransferase Suvar39H1 (HKMT) and of its substrate, the N-terminal 22 amino acids of histone H3 (H3-tag). The HKMT is fused to one of the putative interacting proteins (bait) and the H3-tag to the other (prey). Upon close proximity of bait and prey, the HKMT will trimethylate the lysine 9 residue on the H3-tag, which can be used as a read-out in western-blot analysis. On the example of the interaction between PP2A-Cdc55 and its suggested substrate Net1, which had so far escaped detection by the established approaches, we could successfully establish M-Tracks capability of detecting transient short-lived protein-protein interactions. Furthermore, we were able to show how M-Track may serve as a tool for the validation of proposed interactions between PP2A and its substrates in general. ^Since the methylation-mark generated on the prey during an M-Track assay is persistent, it can also be used to discriminate between prey species before or after the interaction with the tested partner. Therefore, by specifically separating the preys with a methylated H3-tag from those with a nonmethylated one by the use of immunoprecipitations with methylation state-specific antibodies, we can analyze specific biochemical features of each of the two species. By applying this approach to the biogenesis pathway of PP2A we were able to analyze the order of events in the PP2A-biogenesis and could show in vivo a specific activation of the catalytic subunit of PP2A upon the interaction with the chaperone Rrd2. M-Track is an effective and efficient method for the detection of protein-protein interactions in yeast and can easily be adopted by most laboratories without the need for elaborate equipment. It offers a practicable way to verify potential interactions between two proteins and allows the user to distinguish direct from indirect interactions. By combining M-Track assays with the subsequent immunoprecipitation of either the nonmethylated or trimethylated preys, it can help to resolve the order of events in cellular pathways and allows analyzing the effect of the interaction with the bait on the biochemical properties of the prey.

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