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Bibliographic Metadata

Title
Molecular Mechanism of Histone H2B Monoubiquitination
Additional Titles
Molecular Mechanism of Histone H2B Monoubiquitination
AuthorGallego Valle, Laura Dolores
Thesis advisorKöhler, Alwin
Published2018
Description79 Seiten
Institutional NoteMedizinische Universität Wien, Diss., 2018
Annotation
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Arbeit an der Bibliothek noch nicht eingelangt - Daten nicht geprüft
Date of SubmissionApril 2018
LanguageEnglish
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (EN)histone / monoubiquitination / transcription / E3 ligase / nucleosome / acidic patch
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-19113 Persistent Identifier (URN)
Restriction-Information
 The work is publicly available
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Molecular Mechanism of Histone H2B Monoubiquitination [5.44 mb]
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Classification
Abstract (German)

Um die zelluläre Fitness zu gewährleisten, ist es essentiell Chromatin basierte Prozesse gut zu kontrollierten. Dazu gehört die Balance zwischen der Chromatin Kompaktierung und der Zugänglichkeit der DNA, die unter anderem durch posttranslationale Modifikationen (PTM) der Histone reguliert wird. Eine dieser Modifikationen ist die Ubiquitinierung der Histone, bei der das kleine Protein Ubiquitin (Ub) kovalent an Lysine der Histone gebunden wird. Obwohl ein Nukleosom mehr als hundert Lysine enthält, wurden bisher nur wenige sehr spezifische Lysine identifiziert, die tatsächlich ubiquitiniert werden und an der Genregulation beteiligt sind. Insbesondere die Monoubiquitinierung des Histons H2B (H2BUb) ist eine evolutionär stark konservierte Modifikation, die während der DNA Transkription auftritt. Sie verändert den Kompaktierungsgrad des Chromatins und fördert die Rekrutierung von Chromatin modifizierenden Enzymen wie der H3 Methyltransferase. H2B wird von der E2 Ubiquitin-Konjugase Rad6 zusammen mit der E3 Ligase Bre1 ubiquitiniert, die in dieser Kombination in Hefen ausschließlich das Lys123 (äquivalent zum humanen Lys120) von H2B modifizieren. Die Deubiquitinierung erfolgt durch das DUB Modul (DUBm) des Spt-Ada-Gcn5-Acetyltransferase (SAGA) Komplexes. Obwohl die Prinzipien der Ubiquitinierung bereits vor über 15 Jahren entdeckt wurden, ist nur wenig bekannt, wie Bre1 die Aktivität von Rad6 reguliert um eine spezifische Monoubiquitinierung von H2B zu katalysieren. Ebenso wenig weiß man, wie genau das Nukleosom als Substrat erkannt wird.

Ziel dieser Arbeit ist es, genau diese Mechanismen mit Hilfe eines definierten in vitro Ubiquitinierungssystems genau zu untersuchen. Dazu haben wir die Minimalkomponenten des Systems Rad6 und Bre1 zusammen mit rekombinanten Nukleosomen als Substrat verwendet. Mittels Massenspektrometrie gekoppelt mit Protein-Protein Quervernetzung (protein cross-linking) ist es uns gelungen die Topologie des aktiven Proteinkomplexes zu entschlüsseln und für die Interaktion mit dem Nukleosomen kritische Oberflächenbereiche des Enzymkomplexes zu identifizieren. Durch die von uns erzielten Ergebnisse ist es nun möglich ein Model für die molekularen Mechanismen der H2B Ubiquitinierung aufzustellen. Dabei scheint die korrekte Funktion der E3 Ligase Bre1 die Spezifizität für die H2BUb in vielfacher Weise zu gewährleisten. Zum einen interagiert Bre1 mittels zweier separater Domänen mit Rad6. Die N-terminale Rad6 Binde Domäne (RBD) von Bre1 bindet an die dem aktiven Zentrum rückwärtige Seite von Rad6 und moduliert dessen Aktivität. Zusätzlich geht die C-terminale RING Domäne von Bre1 die kanonische Interaktion mit Rad6 ein, bindet nah an dessen aktives Zentrum und reguliert den Transfer von Ubiquitin zum Substrat. Zum anderen erkennt die RING Domäne von Bre1 das Nukleosom und bringt das Rad6Ub Konjugat in die richtige Orientierung und ermöglicht so die zielgenaue Ubiquitinierung des Lys123 des H2B. Schließlich kompetiert Bre1 noch mit dem DUB, um dieselbe Bindungsstelle auf den Nukleosomen, was auf eine weitere regulatorische Rolle innerhalb des Prozesses hinweist. Insgesamt ermöglichen die hier dargestellten Ergebnisse ein besseren Verständnis des Ubiquitins Signalweges innerhalb des Chromatins und erlauben es Rückschlüsse auf die Genregulation zu ziehen.

Abstract (English)

The regulation of chromatin dynamics is essential to maintain cell fitness. Several mechanisms exist to ensure the right balance between chromatin compaction and DNA accessibility, including the post-translational modification (PTM) of histones. Histone ubiquitination is a PTM in which a small protein, ubiquitin (Ub), is linked to lysine residues on the target histone. The nucleosome contains over hundred lysine residues that can be the target of ubiquitination. Nevertheless, only a few specific lysines have been identified to be monoubiquitinated, which are involved in gene regulation. Specifically, histone H2B monoubiquitination (H2BUb) is an evolutionary conserved modification that occurs concurrently during DNA transcription, alters chromatin compaction and promotes the recruitment of other chromatin modifiers, such as H3 methyltransferases. H2BUb is generated by the E2 ubiquitin-conjugating enzyme Rad6, which cooperates with the E3 ligase Bre1 to exclusively target H2B Lys123 in yeast (equivalent to Lys120 in humans). The specific deubiquitinase is the DUB module (DUBm) of the Spt-Ada-Gcn5-Acetyltransferase (SAGA) complex. The ubiquitinating machinery was discovered over fifteen years ago, however, the mechanisms how Bre1 regulates Rad6 activity to achieve such a specific monoubiquitination and how the nucleosomal substrate is recognized are poorly understood.

In this work, we set out to investigate these mechanisms by establishing a controlled in vitro ubiquitination system. We studied the regulation of the minimal component of the ubiquitinating machinery, Rad6 and Bre1, using the nucleosome core particle as substrate. We also applied cross-linking coupled to mass spectrometry to capture the topology of the active protein complex and identify critical protein surfaces for the recognition of the nucleosome. Taken together, we propose a model for the molecular mechanism of H2BUb in yeast. We suggest that the function of the E3 ligase Bre1 ensures specific H2BUb in multiple steps. First, Bre1 interacts through two separate domains with Rad6. The N-terminal domain of Bre1, so called RBD (Rad6 Binding Domain) binds Rad6 backside and modulate its activity. Moreover, the Bre1 C-terminal RING domain is engaged in a canonical interaction close to the active site of Rad6 and mediates ubiquitin transfer to the substrate. Second, the Bre1 RING domain also recognizes the nucleosome and orients the Rad6Ub conjugate to allow the transfer of ubiquitin exclusively to H2B Lys123. Finally, Bre1 competes with the DUBm for the same binding site on the nucleosome, indicating regulatory control of the process. Given the high conservation of the ubiquitinating machinery and the nucleosome, our results could be extrapolated from yeast to humans. Therefore, this study constitutes an important step forward for understanding ubiquitin signaling in chromatin and its implications in gene expression.

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