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Title
Coagulatory potential of macrophage subsets / eingereicht von Julia Kirchbacher
Additional Titles
Koagulatorisches Potential von Makrophagen Subsets
AuthorKirchbacher, Julia
Thesis advisorWojta, Johann
Published2018
Description61 Blatt : Illustrationen, Diagramme
Institutional NoteMedizinische Universität Wien, Diplomarb., 2018
Annotation
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Date of SubmissionAugust 2018
LanguageEnglish
Document typeThesis (Diplom)
Keywords (DE)Atherosklerose / Makrophagen / Microvesicle / Gewebefaktor
Keywords (EN)atherosclerosis / macrophages / tissue factor / microvesicle
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Abstract (German)

Einleitung: Monozyten spielen eine tragende Rolle in der Pathologie der Atherosklerose. Sie befinden sich im “nekrotischen Kern” von Plaques, der nach der Plaque-Ruptur seine prothrombotischen Anteile (z.B. Tissue Factor) freisetzt. Dies führt zur Entstehung von Thromben lokal oder in entfernten Arterien und dadurch zu Komplikationen wie Myokardinfarkten. Eine häufig verwendete Einteilung von Makrophagen ist die binäre Klassifikation in M1 und M2 Makrophagen. M1 Makrophagen, die als proinflammatorisch gelten, führen zur Plaque-Progression, während M2 Makrophagen, die als anti-inflammatorisch gelten, zur Plaque-Regression führen. Zudem können Makrophagen TF+ Microvesicle (MV), Partikel zwischen 100-1000m, freisetzen, welche prokoagulatorische Fähigkeiten besitzen. Bezüglich der MV-Entstehung werden derzeit verschiedene Einflussfaktoren und Pathways, wie Calcium- und Caspase-3-abhängige Entstehungswege, in Betracht gezogen. Der Fokus dieser Studie lag auf der Identifikation von Unterschieden in der MV-Freisetzung von verschiedenen Makrophagen-Subgruppen, insbesondere im Hinblick auf deren Entstehungswege und prokoagulatorischen Fähigkeiten.

Methodik: M1 und M2 Makrophagen wurden durch Stimulation von PBMCs in der Zellkultur gewonnen. Die Stimulation der Makrophagen erfolgte mit M-CSF und IFN-/ LPS (M1) oder IL-4/IL-13 (M2). MV wurden durch Zentrifugation aus den Zellüberständen extrahiert und mittels FACS quantifiziert. Der Einfluss von BAPTA, einem intrazellulären Ca-Chelator, im Stimulationsmedium wurde ebenfalls mittels FACS quantifiziert. Für die TF-Analysen wurde ein TF-ELISA, sowie ein TF-Aktivitäts-Test durchgeführt. Zudem wurden die MV im Hinblick auf den Transport spezifischer Makrophagen-RNA mittels PCR untersucht.

Ergebnisse: Unsere Studie zeigte, dass M2 Makrophagen im Vergleich zu M1 und unstimulierten M0 Makrophagen die meisten MV produzierten. Diese MV zeigten zudem auch die höchste TF-Expression und Aktivität. Es wurde kein Hinweis auf Calcium- oder Caspase-3 abhängige Entstehungswege nachgewiesen. Durch die PCR konnte gezeigt werden, dass alle Makrophagen-MV CD-68 RNA, ein Pan-Makrophagen-Marker, transportieren. M1 Makrophagen, transportierten den M1 spezifischen CD80 Marker.

Abstract (English)

Introduction: Monocytes play a pivotal role in the development of atherosclerosis. They take part in the formation of the necrotic core of atherosclerotic plaques, which release their prothrombotic components, including TF, after rupture. This leads to thrombus formation locally or in distal arteries resulting in complications like myocardial infarction. One commonly used definition of macrophages is the binary classification between the inflammatory M1, enriched in the progressing plaque, and anti-inflammatory M2 macrophages, enriched in the regressing plaque. Additionally, previous studies showed, that macrophages are able to release TF+ MV, particles in the size of 100-1000m, in the cell culture. Different pathways for the formation of these MV, including caspase-3 and calcium related pathways, have been described. The main focus of this study was the identification of differences between macrophage subsets regarding their MV formation and their possible procoagulant activity.

Methods: M1 and M2 macrophages were obtained by differentiation of human PBMCs into monocytes using M-CSF, with following differentiation with IFN-/ LPS (M1) and IL-4/IL-13 (M2) combinations in a medium including M-CSF. MVs were collected from the supernatants and quantified using flow cytometric measurement. The influence of BAPTA, a calcium inhibitor, in the differentiation medium was also quantified using the FACS. For TF-analysis, a TF-ELISA was performed. Because TF-quantity does not always correlate with its activity an additional TF-Activity assay was used. Furthermore, the RNA specific for macrophage subsets and TF in MV was analysed using a PCR.

Results: Our study showed, that M2 macrophages produced the highest amount of MV compared to M1 and unstimulated M0 macrophages. MV of M2 macrophages also showed the highest TF expression and TF activity. No influence of caspase-3 or calcium on the MV releasement was shown. It was proven, that all macrophages carried CD68 (a pan-macrophage marker) RNA and that M1 macrophages carried CD80-RNA. These results give rise to new questions regarding the role of MV of different macrophage subsets in thrombosis in atherosclerosis and their possible use as biomarker in atherosclerotic disease.

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