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Bibliographic Metadata

Title
The role of fibrinolysis inhibition in engineered microvascular networks in multi-organ-chips. / submitted by Severin Mühleder
Additional Titles
Die Rolle der Fibrinolyseinhibition in generierten microvaskulären Netzwerken in Multi-Organ-Chips.
AuthorMühleder, Severin
Thesis advisorWojta, Johann ; Holnthoner, Wolfgang
Published2018
Descriptionxii, 80 Seiten : Illustrationen
Institutional NoteMedizinische Universität Wien, Diss., 2018
Annotation
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Arbeit an der Bibliothek noch nicht eingelangt - Daten nicht geprüft
Date of SubmissionJune 2018
LanguageEnglish
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)Fibrin / Fibrinolyse / Endothelzellen / Vaskularisierung / Organ-on-a-chip
Keywords (EN)Fibrin / Fibrinolysis / Endothelial cells / Vascularization / Organ-on-a-chip
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-18440 Persistent Identifier (URN)
Restriction-Information
 The work is publicly available
Files
The role of fibrinolysis inhibition in engineered microvascular networks in multi-organ-chips. [10.83 mb]
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Classification
Abstract (German)

Die Entwicklung geeigneter Methoden zur Toxizitätsbestimmung von Substanzen oder zur Untersuchung potenzieller Medikamentenwirkstoffkandidaten stellt eine große Herausforderung dar. Derzeit verwendete Testverfahren beruhen immer noch auf transformierten Zelllinien, die unter unphysiologischen Bedingungen kultiviert werden, welche nicht die Komplexität ganzer Organe widerspiegelt. Alternativ dazu werden Labortiere zum Testen in der präklinischen Arzneimittelentwicklung verwendet. Aufgrund ethischer Bedenken, der phylogenetischen Distanz von Tieren und ihrer Verhaltensunterschiede zu Menschen besteht jedoch nach wie vor Bedarf an Testoptionen, welche die menschliche Physiologie angemessen widergeben. Konstruierte menschliche Gewebe oder Miniaturorgane können heutzutage im Labor erzeugt werden, um als kleinste funktionelle Einheit eines ganzen Organs zu dienen und bieten somit eine Lösung für das Problem. In einem System mit miteinander verbundenen Mikrokanälen, Organ-on-a-Chip genannt, können mehrere verschiedene Mini-Gewebe oder Organe enthalten sein. In den meisten mikrofluidischen Plattformen fehlt jedoch den kultivierten Geweben ein intrinsisches Gefäßsystem, wodurch die Möglichkeit einer Medium- oder Blutperfusion eingeschränkt wird.

In der hier vorgestellten Arbeit wurde eine weit verbreitete Co-Kultur-Technik verwendet, um menschliche mikrokapillare Netzwerke in einem Fibrin-Hydrogel zu erzeugen, welche in einer Multi-Organ-Chip-Plattform eingebaut wurden. Endothelzellen, die mit Fettstammzellen co-kultiviert werden, bilden ein vaskuläres Netzwerk und bauen die umgebende Matrix um. Eine wichtige Voraussetzung für die Multi-Organ-Kultur ist die Option, alle Gewebe in demselben Wachstumsmedium zu kultivieren. Daher wurde getestet, ob diese vaskulären Netzwerke in Fibrin unter basalen Mediumbedingungen die Struktur aufrechterhalten können.

Wir konnten in einer mikrofluidischen Chip-Plattform vaskuläre Netzwerke in Fibrin generieren und diese für bis zu zwei Wochen erhalten. Interessanterweise haben wir keine morphologischen Veränderungen der Gefäßnetzwerke als Reaktion auf die Perfusion beobachtet. Es konnten aber signifikante Erhöhungen der Genexpression von CD31, VE-Cadherin und VEGFR-2 in endothelialen Monokulturen aufgrund des Flusses beobachtet werden, was darauf hindeutet, dass Monokulturen der Perfusion ausgesetzt waren. Diese Genexpressionsänderungen wurden allerdings in Co-Kulturen, vermutlich aufgrund von unzureichenden Scherkräften im Hydrogel, nicht gemessen. Besonders ist, dass nach einer kurzen Vorlaufzeit im vollen Wachstumsmedium, vaskuläre Netzwerke im Basalmedium für bis zu zwei Wochen kultiviert werden konnten, indem eine unkontrollierte Fibrinolyse mit dem Antifibrinolytikum Aprotinin inhibiert wurde. Interessanterweise führt die Zugabe von Aprotinin

im vollen Kulturmedium zu einer signifikanten Reduktion der vaskulären Netzwerkdichte im Vergleich zu Testproben ohne Aprotinin. Im basalen Medium jedoch muss Aprotinin zugesetzt werden, da sonst eine Destabilisierung der Gefäßnetzwerke aufgrund von unkontrollierter Fibrinolyse eintritt. Dies deutet darauf hin, dass eine Hemmung der Fibrinolyse für die tierkomponentenfreie Zellkultur von Gefäßnetzwerken erforderlich ist. Diese Ergebnisse tragen zum Verständnis der Zellkultur und des Erhalts von mikrokapillaren Netzwerken in Fibrin-Hydrogelen in Organ-on-Chips bei, die für Medikamententests verwendet werden. Während die fibrinolytische Aktivität durch Faktoren im Wachstumsmedium reguliert wird, führt das Umschalten auf basale Mediumbedingungen zu einer unkontrollierten Fibrinolyse, die zu einer Destabilisierung des vaskulären Netzwerks führt.

Abstract (English)

The development of adequate tools to determine the toxicity of substances or screen for potential drug candidates remains a challenging issue. Several methods still rely on transformed cell lines cultured in non-physiologic conditions that do not resemble the complexity found in whole organs. Alternatively, laboratory animals are used for testing in pre-clinical drug development. However, due to ethical concerns, their phylogenetic distance and behavioral differences to humans there still remains a need for systems that properly reflect human physiology. Engineered human tissues or miniature organs can be generated to serve as the smallest functional unit of a whole organ and thus offer a solution to the problem. Several different mini tissues or organs can be incorporated in a system with interconnected microchannels named organ-on-a-chip. However, in most microfluidic systems cultured tissues lack an intrinsic vasculature thereby limiting the possibility for medium or blood perfusion.

Here, a widely used co-culture technique to generate human microcapillary networks in a fibrin hydrogel incorporated in a multi-organ-chip platform was employed. Endothelial cells co-cultured with adipose-derived stem cells self-assemble into a vascular network and remodel the surrounding matrix. An important prerequisite for multi-organ culture is the ability to culture all tissues in the same growth medium. Therefore, it was determined if developed vascular networks in fibrin can be maintained in basal medium conditions without supplements.

We were able to generate vascular networks in fibrin in a microfluidic chip platform and maintain these cell-laden scaffolds for up to two weeks. Interestingly, we did not observe any morphological changes of vascular networks in response to perfusion. Significant increases in gene expression of CD31, VE-Cadherin and VEGFR-2 in endothelial monocultures could be observed due to flow suggesting that monocultures were exposed to perfusion. These gene expression changes were not observed in co-cultures presumably due to inadequate sensation of shear stress. Importantly, after a priming period in full growth medium vascular networks could be maintained in basal medium for up to two weeks by inhibiting uncontrolled fibrinolysis with the anti-fibrinolytic agent aprotinin. Interestingly, absence of aprotinin in the full culture medium resulted in a significant increase in vascular network density. In basal medium, however, removal of aprotinin results in destabilization of vascular networks as a consequence of premature fibrin degradation. This suggests that inhibition of fibrinolysis is required for animal component-free maintenance of vascular networks.

These results contribute to the understanding of microcapillary network maintenance in fibrin hydrogels on organs-on-chips used for drug testing. While fibrinolytic activity is regulated by the supporting in full growth medium, switching to basal medium conditions results in uncontrolled fibrinolysis leading to failure of vascular network maintenance.

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