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Bibliographic Metadata

Title
The amino terminus specifies the switch between transport modes of the human serotonin transporter / submitted by Carina Kern
Additional Titles
Der Amino-Terminus des humanen Serotonintransporters bestimmt den Wechsel zwischen seinen Transportmodi
AuthorKern, Carina
Thesis advisorSucic, Sonja
Published2018
Description94 Seiten : Illustrationen
Institutional NoteMedizinische Universität Wien, Diss., 2018
Annotation
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Date of SubmissionMay 2018
LanguageEnglish
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)Neurotransmission / Serotonintransporter / Serotonin / Amphetamin / Patch-Clamp-Technik / Künstliche Aminosäuren / Amber-Suppressionstechnologie
Keywords (EN)Neurotransmission / serotonin transporter / amphetamine / serotonin / patch-clamp / unnatural amino acids / amber stop-codon suppression technology
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-18221 Persistent Identifier (URN)
Restriction-Information
 The work is publicly available
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The amino terminus specifies the switch between transport modes of the human serotonin transporter [10.08 mb]
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Abstract (German)

Der Serotonintransporter (SERT) gehört zur Familie der membranständigen Natrium/Chlorid abhängigen Monoamintransporter in neuronalen Synapsen, zu der auch der Dopamintransporter (DAT) und der Norepinephrintransporter (NET) gehören. Ihre terminalen Enden (Amino- und Carboxy-Terminus) sind intrazellulär ausgerichtet sind. Die Rolle von SERT besteht in der Termination der Neurotransmission, indem er Serotonin aus dem synaptischen Spalt, zurück in die Präsynapse schleust. SERT ist von hoher pharmakotherapeutischer Relevanz, da zahlreiche Wirkstoffe, wie Antidepressiva, aber auch Kokain und Amphetamin, die Serotoninwiederaufnahme blockieren. Die daraus resultierenden erhöhten Serotoninspiegel wirken stimmungserhellend und beruhigend, weshalb der Missbrauch psychoaktiver (illegaler) Substanzen häufig ist. Während des Rückransports erfährt SERT strukturelle Konformationsänderungen, in denen er entweder zur extrazellulären oder cytoplasmatischen Seite der Synapse ausgerichtet ist. Die Bindung von Amphetamin bewirkt eine Umkehrfunktion des Transporters mit spontanem Ausstoß (Efflux) von Serotonin, was in direkten Zusammenhang mit dem N-Terminus gebracht wurde. Gezielte N-terminale Modifikationen zeigten, dass dieser als Hebel fungiert, wenn er frei beweglich und bis zu einem gewissen Mindestgrad intakt ist. Um den jeweiligen exakten Aufenthaltsort des N-Terminus während einer Amphetamin-abhängigen Konformationsänderung im SERT-Dimer festzustellen, wurde der Wildtyp mit einer GFP Fluoreszenzmarkierung am N-Terminus in die gewünschte Konformation gebracht, mittels Trypsin verdaut und durch GFP Antikörper detektiert. Bei nach innen gerichteter Konformation blieb der N-Terminus intakt. Dies spricht für eine strukturelle Änderung mit Abschirmung des N-Terminus, wobei er höchstwahrscheinlich innerhalb der Transporterstruktur bzw. zwischen den Untereinheiten der SERT-Dimere bindet. Für diese Studie wurden N-terminale Trunkierungskonstrukte kreiert, bei denen der N-Terminus um 42 (Konstrukt SERT-42), 32 (SERT-32) bzw. 22 Aminosäuren (SERT-22) gekürzt, und auf Funktionalität, Liganden-Bindung und Expression an der Zelloberfläche untersucht wurde. Dabei wurden Auffälligkeiten allein im Effluxverhalten von SERT-32 und SERT-42 gefunden. Um die Konformationszyklen von SERT-22, SERT-32 und Wildtyp zu vergleichen, wurden deren Ionenströme in elektrophysiologischen Untersuchungen gemessen. Während die basalen Ionenströme keine Unterschiede aufwiesen, wurde ein langsamerer kapazitiver Spannungsabfall für SERT-N32 gefunden. Dieses Ergebnis legt eine selektive Funktionsstörung ausschließlich in dieser Mutante nahe, und bestätigt somit das Hebelverhalten des N-Terminus und seine Rolle in der Konformationsänderung von SERT. Ferner zeigte die Substitution der Aminosäuren zwischen den Positionen 22 und 32 durch Alanin eine Verminderung des Substratausstoßes um etwa 50 %, weshalb diese Aminosäuren für die Funktion des N-terminus als maßgebend identifiziert wurden. Um potentielle Interaktionstellen des N-Terminus zu detektieren wurde die photo-sensitive künstliche Aminosäure p-Benzoylphenylalanin (BzF) mittels Amber Stop-Kodon Suppression zwischen den Position 22 und 32 seitenspezifisch eingebracht. Durch eine Anregung mittels UV-Strahlung formt BzF ein Radikal und bindet an nahegelegene Interaktionsstellen. Eine exakte Lokalisation blieb allerdings aufgrund methodischer Limitierungen und schwieriger Optimierung erfolglos. Obgleich der Uneindeutigkeit dieser Daten kann zusammenfassend gesagt werden, dass die Interaktion des N-Terminus mit anderen Regionen des Transporterdimers eine einzigartige Rolle im Amphetamin induzierten Umkehrtransport von SERT spielt. Wie die Literatur berichtet, könnte der Kommunikationsmechanismus zwischen den Termini des Transporterdimers auch für die übrigen Monoamintransporter zutreffen.

Abstract (English)

The serotonin transporter (SERT) is a sodium/chloride-dependent neurotransmitter transporter (NTT) belonging to the solute carrier 6 (SLC6) gene family. It is integrated into the membrane of neurons, with both the amino-/N- and carboxy-/C-terminus located in the cell lumen. Through structural rearrangements (i.e. conformational changes) SERT rapidly terminates neurotransmission via selective re-uptake of serotonin from the synaptic cleft. SERT is closely related to the transporters for norepinephrine (NET) and dopamine (DAT), with both of whom it forms the monoamine neurotransmitter transporter subfamily. All of which are of pharmaco-therapeutic relevance, as they are the target of many drugs, including antidepressants and (recreational) psychostimulants, such as amphetamine and cocaine. Upon amphetamine binding, SERT adopts a reversed function, to release serotonin into the cytoplasm. The N-terminus had been hypothesized to play a major role in the maintenance of amphetamine induced substrate efflux, and specific alterations in this region were found to change these properties. It is thought to act as a lever, allowing the first moiety of the SERT dimer to simultaneously promote efflux from the second one. To probe the conformational changes of SERTs N terminus upon amphetamine binding, in situ proteolysis studies were performed. Subsequent GFP fluorescence detection revealed the N-terminus was more susceptible to proteolytic cleavage when the transporter was in the inward-facing, as opposed to its outward-facing state. This result agrees with findings from truncation mutant experiments: Excluding the first 22 amino acids (construct SERT-N22) of the 85 amino acids comprising N-terminus did not impair efflux versus wildtype SERT. This was not true when at least 32 residues thereof (construct SERT-32) were removed. As for influx and inhibitor binding, different SERT mutants modified within the N-terminal region remained functional. Conversely, those constructs with mutations between residues 22 and 32 were crucial in promoting substrate release. Their substitution with alanine residues reduced substrate efflux by approximately 50 %. Further N-terminal truncation mutants were created and tested in terms of their functional activity, ligand binding and expression at the cell surface. Decreases in substrate efflux were exclusively observed in those SERT constructs with their N-termini shortened by 32 or 42 (constructs SERT-N32 and SERT-N42) amino acids, respectively. Using an additional electrophysiological approach, we examined the individual transporter cycle steps by recording ionic currents along wildtype and mutant SERT (SERT-N22 and SERT-N32). The steady state currents remained essentially unaffected regardless of the respective molecular background tested. However, a lower recovery rate of the capacitive peak indicated significant defects exclusively in cells expressing the SERT-N32 construct. These data suggest a selective impairment in the exchange mode of the SERT-N32 truncation mutant, thus, confirming the N-terminus lever behaviour enabling the switch between SERTs transport modes. To further localize underlying N terminal protein-protein interactions, the amber stop-codon (TAG) technology was utilised. To this end, the unnatural amino acid p-benzoyl phenylalanine (BzF), functioning as a photo-sensitive crosslinker, was inserted into the SERT region between the N-terminal residues 22 and 32. In principle, this approach enables localization of intra- and intermolecular protein interaction. However, methodological limitations rendered the results from these studies inconclusive. In summary, this studys findings suggest the N-terminus interacts with other regions in the SERT dimer and is essential for regulating the transporters amphetamine-induced efflux. As a likely unifying feature among all SLC6 family members, this mode of communication has been reported in the literature.

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