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Bibliographic Metadata

Title
Identification of critical effector proteins in MLL-rearranged Acute Myeloid Leukemia / submitted by Anna Skucha
Additional Titles
Identifikation von kritischen Effektor-Proteinen in MLL-translokierter Akuter Myeloischer Leukämie
AuthorSkucha, Anna
Thesis advisorSuperti-Furga, Giulio
Published2018
DescriptionXIV, 147 Seiten
Institutional NoteMedizinische Universität Wien, Diss., 2018
Annotation
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Date of SubmissionOctober 2018
LanguageEnglish
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)Protein-Protein Interaktion / RNA-Interferenz / MLL-translokierte Leukämie / Akute Myeloische Leukämie / SETD2 / C/EBP alpha
Keywords (EN)Protein-Protein Interaction / RNA-interference / MLL-rearranged Leukemia / Acute Myeloid Leukemia / SETD2 / C/EBP alpha
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-18356 Persistent Identifier (URN)
Restriction-Information
 The work is publicly available
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Identification of critical effector proteins in MLL-rearranged Acute Myeloid Leukemia [13.48 mb]
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Abstract (German)

Die Akute Myeloische Leukämie (AML) resultiert aus einer Vielzahl von wiederkehrenden Mutationen, welche zu einer Differenzierungsblockade und zu unkontrollierter Proliferation von leukämischen Zellen führen. Da die in der AML mutierten Onkoproteine oft in großen Proteinkomplexen vorliegen, stellen wir die Hypothese auf, dass wichtige Effektor-Proteine in der AML in stabilen physischen und genetischen Interaktionsnetzwerken lokalisiert sein könnten, welche das ursprüngliche Onkoprotein einschließen. Ein Ziel dieser Dissertation war es, neue Effektor-Proteine von Onkoproteinen aus der Gruppe der MLL-Fusionen zu finden. Des weiteren wurde der funktionelle Beitrag von Interaktionspartnern von mutiertem Versionen des C/EBP Transkriptionsfaktor zur AML-Entwicklung untersucht. Das MLL-Gen (Mixed Lineage Leukemia) ist in humanen hämatopoetischen Erkrankungen häufig in chromosomalen Translokationen involviert. Diese Translokationen führen zu Fusionen des MLL-Gens mit über 75 verschiedenen Fusionspartnern, was die Entstehung von neuen chimären Proteinen zur Folge hat. Einige bereits identifizierte, kritische Effektorproteine von bestimmten MLL-Fusionsproteinen zeigen ein großes Potential für zielgerichtete Therapien. Es ist jedoch nicht bekannt, ob diese Effektorproteine für die Gesamtheit aller MLL-Fusionsproteinen von Relevanz sind, oder ob für bestimmte MLL-Fusionsproteine verschiedene molekulare Mechanismen der Transformation existieren. Analyse der Interaktionspartner von sieben ausgewählten MLL-Fusionsproteinen (MLL-AF1p, MLL-AF4, MLL-AF9, MLL-CBP, MLL-EEN, MLL-ENL, MLL-GAS7) durch Affinitätschromatographie und Massenspektrometrie (AP-MS) resultierte in einem komplexen Protein-Protein Interaktionsnetzwerk mit >9650 Partnern. Es wurden 128 Proteine identifiziert, die mit mehr als fünf der sieben MLL-Fusionsproteine interagierten. Eine systematische Analyse des konservierten MLL-Fusions-Interaktoms wurde mittels subtraktiven shRNA Screens durchgeführt. Dies führte zur Identifizierung der Methyltransferase SETD2 (SET Domain Containing 2) als kritischer Effektor von MLL-Fusionsproteinen. Funktionelle Charakterisierung von SETD2 in MLL-translokierter Leukämie durch Loss-of-Function Experimente in vitro und in vivo zeigte eine neue Funktion von SETD2 in der Erhaltung der genomischen Integrität während der Leukämie-Initiation und -Progression auf.

Der Transkriptionsfaktor C/EBP ist ein wichtiger Regulator der Expression von myeloiden Genen. N-terminale Frameshift-Mutationen in C/EBP wurden in 9% aller AML-Patienten gefunden. Diese Mutationen heben die Rolle einer verkürzten Form von C/EBP (p30) in der Leukämie-Entstehung hervor. Wir konnten die Interaktion von C/EBP p30 mit dem WDR5/MLL

Komplex mittels AP-MS nachweisen. Weiters konnte wir zeigen, dass Wdr5 für die Differenzierungsblockade und Leukämieentstehung in C/EBP mutierten Zellen verantwortlich ist. Zusätzlich testeten wir die neue niedermolekulare Substanz OICR-9429, welche als potenter Wdr5-Antagonist wirken kann. OICR-9429-vermittelte Störung der Interaktion zwischen Wdr5 und MLL, konnte die Differenzierungsblockade von C/EBP p30-exprimierenden Zellen aufheben. Zusammenfassend unterstreichen unsere Daten die funktionelle Relevanz von kombinierten zellulären Proteomik- und Genomik-Screens zur übergreifenden und vergleichenden Identifizierung von kritischen Effektorproteinen in der AML. Somit tragen unsere Studien zu einer weiteren Aufklärung von molekularen Mechanismen der Leukämieentstehung bei.

Abstract (English)

Acute Myeloid Leukemia (AML) is driven by a number of recurrent mutations, which result in irrepressible growth and block of differentiation of leukemic cells. As the mutated proteins are often embedded in large macromolecular complexes we hypothesized that effector proteins empowering leukemogenesis might be encoded in stable physical and genetic interaction networks surrounding the initial oncoprotein. In this thesis, I aimed to identify common critical effectors of a subset of distinct MLL-fusion proteins. Moreover, we investigated the functional contribution of interactors of mutant C/EBPproteins to AML development. The Mixed Lineage Leukemia gene (MLL) is a frequent target of chromosomal rearrangements in human hematopoietic malignancies. Balanced translocations result in the fusion of the MLL gene to over 75 different fusion partner genes, leading to the production of novel chimeric proteins. Critical effectors of distinct MLL-fusion proteins have previously been identified, and some of them were shown to hold great potential for targeted therapies. However, it is not clear whether these effectors are conserved among all MLL-fusion proteins or if different molecular mechanisms of transformation exist for distinct MLL-fusion proteins. Characterization of the protein complexes nucleated by 7 MLL-fusion proteins (MLL-AF1p, MLL-AF4, MLL-AF9, MLL-CBP, MLL-EEN, MLL-ENL, MLL-GAS7) by affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) revealed a densely interconnected protein-protein interaction network. 128 proteins were found to interact with 5 of all 7 MLL-fusions. Systematic functional investigation of the conserved MLL-fusion interactome, using subtractive shRNA screens, identified the methyltransferase SETD2 as a critical effector of MLL-fusion proteins. Functional characterization of the role of SETD2 in MLL-rearranged leukemia through loss of function experiments in vitro and in vivo established a novel role for SETD2 in the maintenance of genomic integrity during initiation and progression of MLL-rearranged AML. N-terminal frameshift mutations in the transcription factor C/EBP, a master regulator of myeloid gene expression, have been found in 9% of patients presenting with AML, highlighting the role of the short isoform C/EBP p30 in disease development. We identified the Wdr5/MLL containing complex as an interactor of the C/EBP p30 variant. Wdr5 was responsible for the differentiation block and leukemia development of C/EBP-mutated cells. Furthermore, we have characterized the new small molecule compound OICR-9429 as a potent Wdr5 antagonist. OICR-9429 disrupts the interaction between Wdr5 and MLL, thus restoring myeloid differentiation potential of C/EBP p30-expressing cells.

In summary, our data highlight the functional relevance of combined proteomic-genomic cellular screening to identify critical effectors of genes involved in the development of acute myeloid leukemia in a comprehensive and comparative manner. Our studies contribute to further clarification of the molecular mechanisms driving leukemogenesis.

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