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Bibliographic Metadata

Title
Calcium-sensing receptor and its downstream signalling in colon cancer cells / submitted by Samawansha Harsheni Tennakoon
AuthorTennakoon, Samawansha Harsheni
CensorKallay, Enikö
Published2015
Description119 Bl. : Ill., graph. Darst.
Institutional NoteWien, Med. Univ., Diss., 2015
Annotation
Zsfassung in dt. Sprache
LanguageEnglish
Bibl. ReferenceOeBB
Document typeDissertation (PhD)
Keywords (DE)Kalzium / Kalzium sensitive Rezeptor / Kolon / Kolorektalkarzinom / zellulärer Kalziumsignale
Keywords (EN)Calcium / Calcium-sensing receptor / colon / colon cancer / cell signalling
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-18110 Persistent Identifier (URN)
Restriction-Information
 The work is publicly available
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Calcium-sensing receptor and its downstream signalling in colon cancer cells [25.39 mb]
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Abstract (German)

Das Kolorektalkarzinom zählt zu den häufigsten Malignomen in industrialisierten Ländern. Es ist die dritthäufigste Krebserkrankung bei Männern und die zweithäufigste bei Frauen. Ernährung und Lifestyle haben einen entscheidenden Einfluss auf die Entstehung des Kolorektalkarzinoms, wobei Vitamin D3 und Kalzium chemopräventive Wirkungen zugeschrieben werden. Wie Studien unserer Forschungsgruppe zeigten, spielt der sogenannte Kalzium sensitive Rezeptor (CaSR) eine wichtige Rolle in der Vermittlung dieser chemopräventiven Wirkungen. Als Regulator des Kalziumhaushalts, steuert der CaSR wichtige Schritte in der Aufnahme und Ausscheidung von Kalzium. Darüber hinaus wird dem CaSR, dessen Expression im malignen transformierten Kolonzellen deutlich reduziert ist, die Funktion eines Tumorsuppressors zugeschrieben. Der CaSR kann durch eine Vielzahl von Liganden aktiviert werden, was zur Aktivierung untergeordneter Signalkaskaden über verschiedene G-Proteine führt. Es sind dabei vier verschiedene G-alpha Untereinheiten involviert. Das Ziel der Dissertation bestand darin, die durch den CaSR vermittelte Signaltransduktion im Kolonkarzinomzellen zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit habe ich den Einfluss des CaSR auf intrazelluläre Kalziumsignale, cAMP Produktion, Phosphoproteinexpression und -aktivierung in Kolonkrebszelllinien untersucht. Dafür wurde einerseits die Expression des Rezeptors verändert (mit Hilfe einer Zelllinie, die den CaSR stabil überexprimiert) und andererseits dessen Aktivität (durch Behandlung mit Ca2+ und pharmakologischen Modulatoren des CaSR). Intrazelluläre Kalziumsignale wurden mit Hilfe des Kalzium-sensitiven Farbstoffs Fluo4 und GCaMP Sensoren untersucht. Die Produktion von cAMP wurde mit einem Alphascreen cAMP Assay nachgewiesen. Außerdem habe ich zwei verschiedene Screeningmethoden verwendet um den Einfluss des CaSR auf die Proteinaktivierung zu untersuchen. Die Ergebnisse wurden mit Hilfe von Western Blot, In-Cell Western Arrays und Immunfluoreszenzfärbung bestätigt. Während in Kolonkrebszellen die Stimulation des CaSR keinen Einfluss auf intrazelluläre Kalzium Oszillationen hatte, führte sie zu einer Hochregulierung der cAMP Produktion nach 15 Minuten. Interessanterweise war nach Aktivierung des CaSR die Phosphorylierung von CREB, einem cAMP-abhängigen Transkriptionsfaktor, vermindert. Nur wenige Phosphoproteine wiesen nach Stimulation des CaSR Veränderungen in der Expression oder Aktivität auf. Stimulation und Überexprimierung des CaSR führte einerseits zu einer Hinuterregulierung der Ca2+-vermittelten ERK1/2 Phosphorylierung und andererseits zu einer Zunahme der Translokation von NFκB in den Zellkern. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in Kolonepithelzellen, aufgrund fehlender intrazellulärer Kalziumoszillationen, der CaSR nicht an ein Gαq gekoppelt ist. Aufgrund der erhöhten cAMP Produktion in diesen Zellen, erscheint die Kopplung des CaSR an ein Gs oder G12/13 wahrscheinlich. Das erhöhte GSK-3beta Level in diesen Zellen könnte eine mögliche Ursache für die CaSR-vermittelte Hochregulierung von NFκB.

Abstract (English)

In industrialised countries colorectal cancer is the third most common cancer in men and the second in women. Diet and life-style are crucial factors influencing colorectal tumourigenesis. Dietary vitamin D3 and calcium are well-defined chemopreventive agents in the colon. Our group recently demonstrated the importance of the calcium-sensing receptor (CaSR) in maintaining the chemopreventive role of vitamin D in the colon (Aggarwal et al, 2015a). The main role of the CaSR is the regulation of calcium homeostasis by regulating calcium (Ca2+) absorption, circulation, and excretion. CaSR, which acts as a tumour suppressor in the colon, is expressed in significantly lower level in transformed colon cells. CaSR activation can be achieved by a range of different ligands. As a G protein-coupled receptor, upon ligand binding CaSR triggers downstream signalling through stimulation of G proteins. Since the CaSR is known to regulate a wide network of signalling via four G-alpha subunits in other tissues, the current study was focused to investigate the signalling pathways regulated by the CaSR in colon cancer cells. In this study I investigated the role of the CaSR on intracellular Ca2+ ([Ca2+]int) signalling, cAMP synthesis, protein expression and activation, by modulation of the CaSR expression (using a stable cell line overexpressing CaSR) and the activity (using Ca2+ and pharmacological CaSR modulators). The [Ca2+]int signal was determined by Fluo4 Ca2+ imaging and by using a GCaMP sensor while cyclic adenosine monophosphate (cAMP) synthesis was tested by alphascreen cAMP assay. Two screening methods (human phospho kinase array, RPPA) were used to examine the influence of active CaSR on protein activation and expression. Western blotting, in-cell western and immunostaining confirmed the results. ^Stimulation of the receptor had no effect on [Ca2+]int oscillations in colon cancer cells while it upregulated the cAMP synthesis after 15 minutes in a CaSR-dependent manner. Interestingly, the phosphorylation of the cAMP downstream target CREB was downregulated by active CaSR. Only a limited number of phospho protein alterations were observed after CaSR stimulation. In CaSR-overexpressing cells Ca2+-induced Erk1/2 phosphorylation was downregulated while NFκB nuclear translocation was upregulated. In conclusion, this study suggested that the CaSR is not coupled to Gq due to the lack of [Ca2+]int signal but possibly linked to Gs or G12/13 because of the increased cAMP production in the colon. Increased levels of GSK-3beta could be a possible cause for CaSR-dependent NFκB upregulation in these cells.

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