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Titelaufnahme

Titel
Survival patterns of starving Legionella - implications for diagnostics and infection of host cells
Weitere Titel
Überlebensdynamik von hungernden Legionellen - Konsequenzen für die Diagnostik und die Infektion von Wirtszellen
Verfasser / VerfasserinSchrammel, Barbara
GutachterKirschner, Alexander
Erschienen2018
Umfang122 Seiten
HochschulschriftMedizinische Universität Wien, Diss., 2018
Anmerkung
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Arbeit an der Bibliothek noch nicht eingelangt - Daten nicht geprüft
Datum der AbgabeSeptember 2018
SpracheEnglisch
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Legionellen / L. pneumophila / L. micdadei / VBNC / kultivierungs-unabhängige Detektion / lebend aber nicht mehr kultivierbar
Schlagwörter (EN)Legionella / Legionella pneumophila / L. micdadei / VBNC / viable but nonculturable / starvation / viability / resuscitation / direct detection / cultivation-independent detection
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-19409 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
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Survival patterns of starving Legionella - implications for diagnostics and infection of host cells [13.13 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Legionellen können in beheizten Wassersystemen oder Kühltürmen zu hohen Zahlen heranwachsen. Das Einatmen kontaminierter Aerosole stellt ein Gesundheitsrisiko für Menschen dar. Normalerweise replizieren sich Legionellen intrazellulär in ihren natürlichen Wirten, den freilebenden Amöben. Makrophagen der Lunge können in ähnlicher Weise als Wirte dienen und Legionellan werden zu Erregern einer schweren Lungenentzündung, der Legionärskrankheit. Bei Desinfektion oder nährstoffarmen Bedingungen können Legionellen ihren physiologischen Zustand von kultivierbar auf lebensfähig, aber nicht mehr kultivierbar (viable but nonculturable, VBNC) verändern. Sie sind daher mit herkömmlichen Kultivierungsmethoden nicht mehr nachweisbar.

Um das Potenzial von Legionellen zur Bildung von VBNC-Zellen zu testen, parallel dazu ihre Infektiosität für verschiedene Wirtszelltypen und die Populationsdynamik während der Transformation in den VBNC-Status und des langfristigen Hungerns zu untersuchen, wurden in dieser Studie sechs Legionellen-Stämme unter nährstofflimitierten Bedingungen in Reinstwasser-Mikrokosmen gehalten und bis zu einem Jahr lang bei 45C überwacht. Indikatoren der Lebensfähigkeit, die Infektiosität in Co-Kulturen mit Amöben und menschlichen Wirtszellen, die Wiederbelebung der VBNC-Zellen auf Standard-Agarplatten und die Entwicklung von Epitopen der äußeren Membran mit spezifischen Antikörpern wurden analysiert.

Bei allen sechs Legionellen-Stämmen haben wir eine tri-phasische Entwicklung der Populationsdynamik beobachtet. In der ersten Phase verloren alle Stämme gleichzeitig mit ihrer Kultivierbarkeit (<1 KBE/mL, 8 log10-Stufen Reduktion) ihre Infektiosität in Co-Kultur-Tests, mit Ausnahme einiger seltener Infektionsereignisse. Mindestens 10% der anfänglich kultivierbaren L. pneumophila Zellen konnten VBNC-Zellen bilden, die vor allem durch geringe Enzymaktivität und intakte bis teilweise geschädigte Membranen charakterisiert waren. Zellen mit hoher Esterase-Aktivität wurden um 2-4 log10-Stufen reduziert. Die zweite Phase des Experiments war gekennzeichnet durch eine stabile VBNC-Population für mehr als 100-200 Tage je nach Stamm. Bei allen L. pneumophila-Stämmen konnten die meisten Epitope der äußeren Membran unabhängig von ihrem Lebensfähigkeitsstatus nachgewiesen werden. Infizierte Wirtszellen in den Co-Kulturen (mikroskopische Observation) wurden selten beobachtet, Wiederbelebung auf Agarplatten nie. In einem sehr kleinen Teil der VBNC-Population (1-0,05% der Gesamtpopulation) fanden wir Zellen mit hoher Esterase-Aktivität. In der dritten Phase des Experiments (ab 200 bis 400 Tage) begannen die VBNC-Populationen zu sterben, behielten aber zum Großteil mit geringen Reduktionen ihre äußeren Membran-Epitope. Ein kleiner Teil der VBNC-Zellen konnte jedoch Wirtszellen wie Amöben und primäre menschliche Makrophagen infizieren und wurde gelegentlich sogar auf Standard-Agarplatten wieder kultivierbar.

Wir vermuten, dass diese infektiöse Population höchstwahrscheinlich auch hohe Esterase-Aktivität aufweist und eine stochastisch wiedererwachte Subpopulation sein könnte. Diese Zellen könnten nach Desinfektionsmaßnahmen für Re-Kolonisierungsereignisse verantwortlich und für die menschliche Gesundheit von Belang sein. Darüber hinaus wird die Definition von Resuscitation neu interpretiert, da die Replikation von VBNC-Bakterien in Wirtszellen ohne Wachstum auf Standard-Agarplatten häufig beobachtet wurde. Es zeigt sich durch die langfristige Persistenz der äußeren Membran-Epitope die gute Anwendbarkeit von Antikörper-basierten, Kultur unabhängigen Methoden zur Isolierung und Detektion sowohl kultivierbarer als auch von VBNC L. pneumophila Zellen. Generell sollten VBNC-Legionellen in gesundheitlichen Fragen ernster genommen werden, da gezeigt wurde, dass sie menschliche Zellen in vitro direkt infizieren können und unter ungünstigen Bedingungen sehr persistent vorhanden sind.

Zusammenfassung (Englisch)

Legionella bacteria may grow to high numbers in heated water systems or cooling towers and pose a health risk for people inhaling contaminated aerosols. Usually, legionellae replicate intracellularly in their natural hosts, the free-living amoebae (FLA). Macrophages of the lungs may serve as hosts in a similar way depending on the immune-status of the person and the virulence characteristics of the Legionella strain. Thus, legionellae, mainly the species L. pneumophila, are the causative agent of a severe atypical lung infection called Legionnaire s disease. Disinfection treatments or nutrient deprived conditions, can trigger legionellae to change their physiological state from culturable to viable but nonculturable (VBNC). They are thus not detectable by standard cultivation methods anymore. Their infectivity in amoeba co- cultures and subsequent infectivity in human cell lines was documented but never the direct infection of human cells. Furthermore, no detailed studies are available which compare comprehensively the VBNC formation potential of various strains and in parallel their virulence for different host cell types and which look in depth at the population dynamics during the transformation and long-term starvation of the VBNC community.

Therefore, in this study six Legionella strains were starved and monitored for their VBNC cell formation in ultrapure water at 45C for up to one year. Multiple indicators of viability, infectivity in co-culture assays with amoeba and human host cells, resuscitation on agar plates and the development of outer-membrane epitopes with specific monoclonal antibodies which are potentially usable for detection applications were analysed.

For all six Legionella strains, we observed triphasic viability patterns due to starvation conditions. In the first phase, all strains lost along with their culturability (<1 CFU/mL, 8 log10 units of reduction) predominantly their infectivity in co-culture assays with the exception of some rare infection events. At least 10% of the initial culturable L. pneumophila populations were able to form VBNC cells which were mainly characterized by low metabolic activity and intact to partly damaged membranes. The high metabolically active (esterase activity) cells were reduced by 2-4 log10 units along with culturability. The total number of DNA-containing cells were stable during the whole experimental phase. In the second phase of starvation the VBNC populations were stable in terms of cell numbers for more than 100-200 days depending on the strain. All L. pneumophila strains kept most of the tested outer-membrane epitopes of the LPS and the MOMP independently of their viability status, infection in the co-culture assays (microscopic observation) occurred rarely and never resuscitation on nutrient agar plates. In a very small part of the VBNC population (1-0.05% of the whole population), we found high esterase activity. In the third phase of starvation, between 200 and 400 days the VBNC populations started to die but mostly still keeping their outer-membrane epitopes. However, a certain small part of the VBNC cells were still able to infect host cells, like amoebae and primary human macrophages and were occasionally even resuscitating on nutrient agar plates.

We hypothesize that this infective and most probably highly metabolically active population of long-term starved VBNC cells might be a stochastically reawakened sub-population. These cells could be responsible for recolonization events after disinfection measures and might be of concern for human health. Furthermore, the definition of resuscitation is discussed, because replication of VBNC bacteria in host cells without regrowth on nutrient agar plates was often observed. Moreover, the long-term persistence of most of the studied outer-membrane epitopes of the LPS and the MOMP demonstrates the applicability of antibody-based culture independent techniques to isolate and detect both, culturable and VBNC L. pneumophila cells from water samples. However, the presence of the epitopes is not an indication of viability. In general, VBNC Legionella cells should be taken more seriously concerning health issues as we showed that they can directly infect human cells in vitro and are highly persistent during adverse conditions and thus most probably even more difficult to treat.

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