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Titelaufnahme

Titel
An analysis of the action of partial releasers on the conformational cycle of the serotonin transporter
Weitere Titel
Eine Analyse der Wirkung von 'partial releasers' auf den Konformationszyklus des Serotonin transporter
Verfasser / VerfasserinBhat, Shreyas
GutachterFreissmuth, Michael
Erschienen2018
Umfang105 Seiten
HochschulschriftMedizinische Universität Wien, Diss., 2018
Anmerkung
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Arbeit an der Bibliothek noch nicht eingelangt - Daten nicht geprüft
Datum der AbgabeJuli 2018
SpracheEnglisch
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Chaperone / Dopamin-Transporter / Elektrophysiologie / Serotonin / Serotonin-Transporter
Schlagwörter (EN)Chaperone / Dopamine transporter / Electrophysiology / Serotonin / Serotonin transporter
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-19413 Persistent Identifier (URN)
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An analysis of the action of partial releasers on the conformational cycle of the serotonin transporter [11.91 mb]
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Zusammenfassung (Deutsch)

Die Wiederaufnahme der Neurotransmitter Serotonin, Dopamin and Norepinephrin wird durch die entsprechenden Transporter (SERT, DAT, NET) vermittelt. Daher beenden sie einerseits die neuronale Signalübertragung und ermöglichen andererseits die Befüllung der synaptischen Vesikel mit Neurotransmittern, die für nachfolgende Signalübertragung wieder zur Verfügung stehen. Punktmutationen von SERT und DAT können zur Fehlfaltung der Transporter führen. Diese faltungsdefizienten Transporter werden im endoplasmatischen Retikulum (ER) zurückgehalten, weil die Qualitätskontrolle durch zytosolische Proteine und durch Proteine im Lumen des ER die Transporter verhindert, dass die mutierten Proteine in den sekretorischen Weg eingeschleust werden. Daher erreichen sie nicht die Zelloberfläche und stehen auch nicht für ihre Funktion, den Transport von Neurotransmittern, zur Verfügung. Faltungsdefiziente Mutationen von DAT sind klinisch relevant, weil sie zu einem Syndrom von Dystonie and Parkinsonismus führen. Dieses Dopamintransporter-Defizienz-Syndrom (DTDS) kann sich je nach der Art der Mutation zu unterschiedlichen Zeitpunkten manifestieren: Wenn der Faltungsdefekt gravierend ist, treten Symptome bereits bei Säuglingen auf. Mutationen, die mit einer residualen Transporteraktivität verbunden sind, führen zu einer juvenilen Form der Erkrankung. Einige dieser klinisch relevanten DAT-Mutanten können durch derzeit verfügbare Pharmakochaperone wie Noribogain und Bupropion korrigiert werden. Diese kleinen Moleküle binden an Faltungsintermediate der Transporter und korrigieren den Faltungsdefekt, indem sie die Energiebarrieren herabsetzen, die durch die Mutation im Faltungstrajektorium erzeugt werden. Dieser Effekt führt zur Wiederherstellung der Expression von Transportern an der Zelloberfläche und damit der Wiederaufnahme von Dopamin. Allerdings kann die Funktion bei der überwiegenden Zahl der DTDS-assoziierten DAT-Mutanten durch Noribogain oder Bupropion nicht wieder hergestellt werden. Daher besteht ein Bedarf an weiteren Pharmakochaperonen.

Die vorliegende Arbeit stellt einen rationalen Zugang vor, wie potentielle Pharmakochaperone identifiziert werden können. Die Arbeitshypothese postuliert, dass Liganden als Pharmakochaperone wirken, wenn sie atypisch an SERT (und DAT) binden, d.h. in Konformationen einfrieren, die sich von denjenigen unterscheiden, in denen die Transporter in Gegenwart von typischen Inhibitoren und Substrates akkumulieren. Diese Annahme wurde experimentell überprüft: 1) Zunächst wurde der Wirkungsmechanismus von drei Amphetamin-ähnlichen Naphthylpropanaminen geklärt; PAL-1045, eines dieser Analoga, wirkt als partieller Freisetzer, der im Vergleich zum vollen Freisetzer p-Chloroamphetamin nur eingeschränkt Serotonin durch Transportumkehr aus Zellen freisetzt. 2) Die partielle Freisetzung wurde darauf zurückgeführt, dass PAL-1045 SERT in konformationellen Intermediaten einfriert. Folgerichtig wirkte PAL-1045 auch als Pharmakochaperon: Die Faltung der Mutante SERT-601PG602-AA wurde durch PAL-1045 teilweise korrigiert. 3) Mit PAL-1045 konnte die Rolle der Binding von Na+ und K+ im Transportzyklus von SERT untersucht werden. Mit diesen Beobachtungen konnte ein kinetisches Modell formuliert werden, in der die Bindung von Substrat und Cosubstrat-Ionen (Na+ und Cl-) in zufälliger Reihenfolge aber kooperativ stattfindet. Dieses Modell liefert nicht nur eine korrekte mechanistische Beschreibung des physiologischen Transportzyklus von SERT sondern auch der Transmitterfreisetzung durch Amphetamine und seine Analoga.

Zusammenfassung (Englisch)

Transporters for the monoamines serotonin (SERT), dopamine (DAT) and norepinephrine (NET) are integral membrane proteins, which function in reuptake and homeostatic recycling of extra-neuronal monoamines into synaptic vesicles. Hence, their actions effectively terminate neuronal signalling and provide for retrieved neurotransmitters to be reused for subsequent rounds of neurotransmission. Point mutations in SERT and DAT can cause misfolding of the transporters. Misfolded transporters are retained within the endoplasmic reticulum (ER) by a rigorous quality control machinery that employs cytosolic and ER luminal proteins. As a consequence, protein trafficking to the plasma membrane is impaired leading to loss of transporter function. Such mutations in DAT have clinical implications, because they result in a syndrome of dystonia and Parkinsonism in the affected individuals. The age of onset of this dopamine transporter deficiency syndrome (DTDS) depends on the nature of the mutation(s): severe folding deficiency results in an infantile onset. Mutations, which allow for some residual transport activity, lead to the juvenile form. A limited number of clinically relevant DAT mutants can be rescued by currently available pharmacochaperones like noribogaine and bupropion. These small molecules bind to mutant transporters and assist in correcting folding deficits by lowering energy barriers imposed by mutations within the protein folding trajectory. This restores surface expression and transporter function. However, the majority of DTDS-associated DAT mutants cannot be rescued with noribogaine or bupropion. This unmet medical need justifies the search for additional pharmacochaperones.

The current thesis proposes a rational approach to screen for new ligands as potential pharmacochaperones. The underlying hypothesis posits that ligands can act as pharmacochaperones, if they exhibit atypical binding profiles to SERT (and DAT) and trap transporters in unique conformational states. The present work provides a proof of concept supporting this hypothesis: 1) The investigations focused on exploring the mechanism of action of naphthyl-propan-amines; one of the analogues PAL-1045, acts as a partial releaser, when compared to the full releaser p-chloroamphetamine. 2) This was linked to the ability of PAL-1045 to trap SERT in conformational intermediates, a property, which also conferred a pharmacochaperoning action to PAL-1045: folding of the ER-retained SERT-601PG602-AA mutant was restored in part by PAL-1045. 3) PAL-1045 allowed for interrogating the role of Na+ and K+ binding in the transport cycle of SERT: a kinetic model was proposed based on random, but cooperative, binding of substrates and co-substrate ions. This model provides for a mechanistic framework that explains not only the physiological transport cycle of SERT but also the releasing action of amphetamines.

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