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Titelaufnahme

Titel
Entry and Uncoating of ICAM-1 binding Rhinovirses in HeLa cells
Weitere Titel
Eintritt und RNA-Freisetzung von ICAM-bindenden Rhinovirenin HeLa-Zellen
Verfasser / VerfasserinGanjian, Haleh
GutachterFuchs, Renate
Erschienen2018
Umfang109 Seiten
HochschulschriftMedizinische Universität Wien, Diss., 2018
Anmerkung
Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
Arbeit an der Bibliothek noch nicht eingelangt - Daten nicht geprüft
Datum der AbgabeAugust 2018
SpracheEnglisch
DokumenttypDissertation
Schlagwörter (DE)Rhinoviren / Eintritt / RNA-Freisetzung / Endozytosewege
Schlagwörter (EN)Rhinovirus / Entry / RNA-uncoating / Endocytosis
URNurn:nbn:at:at-ubmuw:1-19329 Persistent Identifier (URN)
Zugriffsbeschränkung
 Das Werk ist frei verfügbar
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Entry and Uncoating of ICAM-1 binding Rhinovirses in HeLa cells [14.24 mb]
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Klassifikation
Zusammenfassung (Deutsch)

Das erste Projekt dieser Arbeit konzentriert sich auf die Charakterisierung der Endozytosewege von drei verschiedenen Vektoren auf der Basis von festen Lipidnanopartikeln (SLNs) in HeLa Zellen. SLNs sind ein neues optimiertes Gen-Delivery-System zur Behandlung mehrerer Erkrankungen. In der Gentherapie muss das therapeutische Gen durch das Zytoplasma in den Kern von Wirtszellen transportiert werden, damit danach die Transkription und Proteinsynthese erfolgen kann. Die Diversität der Eintritts- und intrazellulären Routen kann die Transfektionseffizienz verschiedener Vektoren beeinflussen. Um die zelluläre Aufnahme und Transfektion verschiedener SLN-Vektoren in HeLa-Zellen zu untersuchen, verwendeten wir verschiedene Inhibitoren, die unterschiedliche Wege blockieren. Unsere Daten zeigen, dass jeder endozytische Inhibitor unterschiedlich mit der zellulären Aufnahme und der Transfektionseffizienz jedes Vektors in HeLa-Zellen interferiert. Am Ende fanden wir, dass die DNA-SLN-basierten Vektoren über mehrere Eintrittswege produktiv in die Zellen gelangen.

Das zweite und dritte Projekt zielte darauf ab, Einblicke in den Mechanismus des Eintritts und der RNA-Freisetzung von ICAM-1 bindenden Rhinovirus in HeLa-Zellen zu erhalten. Rhinoviren sind die Hauptursache für eine Erkältung, da es zu einer Infektion der oberen und unteren Atemwege kommt. Rhinoviren gehören zum Genus Enterovirus und der Familie der Picornaviridae. Basierend auf der Phylogenie werden sie in drei Spezies A, B und C eingeteilt. Die meisten RV-A und alle RV-B binden an das ICAM-1, während nur 12 Serotypen von RV-A an Mitglieder der LDL-Rezeptor Familie binden, um in die Zellen einzudringen. CDHR3 vermittelt den Eintritt von RV-C. RV-A89 tritt durch Bindung an den ICAM-1-Rezeptor, so wie RV-B14, in die Zellen ein. Obwohl RV-A89, ähnlich wie RV-B14, in frühe Endosomen aufgenommen wird, konnte es im Gegensatz zu RV-B14 nicht in späten Endosomen nachgewiesen werden. Durch Verwendung verschiedener Substanzen, die den lysosomalen Weg (EGA) oder den Recycling-Weg inhibieren (Nocodazol, Ciliobrevin A), zeigen wir dass RV-A89 und RV-B14, trotz der Verwendung des gleichen Rezeptors, ihr virales Genom aus unterschiedlichen endosomalen Kompartimenten freisetzen. Das unterschiedliche Verhalten von RV-A89 hat uns veranlasst, unser Wissen über Eintrittsmechanismen und die RNA-Penetration von ICAM-1-bindenden RVs in HeLa-Zellen weiter zu untersuchen. Daher studierten wir die Endozytosewege von vier Typen von ICAM-1-bindenden RVs: RV-B3, RV-B14, RV-A16 und RV-A89. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Internalisierung von RV-B14 und RV-A89 über mehrere Wege erfolgt. Sie treten in die Zellen durch Clathrin-, Dynamin- und Lipid-Rafts / Caveolae-vermittelte Endocytosewege, sowie über Makropinozytose ein. Die Anwendung von Inhibitoren, die die Aktinfunktion beeinflussen, zeigt, dass alle vier Serotypen das Aktinzytoskelett und Makropinozytose für die Zellinternalisierung benötigen. Anschließend untersuchten wir den Einfluss eines Dynein-Inhibitors (Ciliobrevin) auf alle vier Serotypen. Ciliobrevin blockiert den Genomtransfer von RV-A16 und RV-A89, nicht jedoch von RV-B3 und RV-B14, was auf den Transport von RV-A16 und RV-A89 zu Endozytotischen Recycling-Kompartimenten für die produktive RNA-Freisetzung hinweist. Zusammenfassend würden diese Ergebnisse die Entwicklung antiviraler Mittel unterstützen, die auf den Eintritt oder intrazellulären Transport aller Rhinovirus-Serotypen abzielen.

Zusammenfassung (Englisch)

The rst project of this thesis focuses on the characterization of the endocytic pathways taken by three different vectors based on solid lipid nanoparticles (SLNs) in HeLa cells. SLNs are a new optimized gene delivery system for the treatment of several disorders. In gene therapy, the curative genetic material must be transferred through the cytoplasm to the nucleus of host cells for transcription and protein synthesis. The diversity of entry and intracellular routes may affect the transfection efficiency of different vectors. To explore cellular uptake and transfection of various SLN vectors in HeLa cells, we employed different inhibitors which block distinct pathways. Our data reveal that each endocytic inhibitor interferes differently with cellular uptake and transfection efficiency of the respective vector in HeLa cells. In the end, we demonstrated that the DNA-SLN based vectors productively enter the cells via multiple entry pathways.

The second and third projects are aimed to identify the endocytosis routes taken by ICAM-1 binding rhinoviruses as well as the determination of their uncoating site in HeLa cells. Rhinoviruses (RVs) are the major causative agents of the common cold thus being involved in respiratory tract diseases. RVs are part of the genus Enterovirus that is categorized to the family Picornaviridae. Based on phylogeny they are divided into three species RV-A, -B and -C. Most of RV-As and all RV-Bs bind to intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1; the major group), while only 12 serotypes of RV-A bind to the low-density lipoprotein receptor (LDLR; the minor group) family to enter cells. Entry of RV-C is mediated by the cadherin-related family member 3 (CDHR3). RV-A89 enters the cells via binding to the ICAM-1 receptor as well as RV-B14. Although RV-A89 is similar to RV-B14 and internalizes into early endosomes, there was no evidence for RV-A89 to uncoat from compartments of the lysosomal route as RV-B14. Applying some inhibitors interfering with different endocytic pathways, such as the lysosomal pathway inhibitor (EGA) or the recycling route inhibitors (nocodazole, ciliobrevin A), we reveal that, despite using the same receptor, RV-A89 and RV-B14 uncoat from distinct endosomal compartments. The different behavior of RV-A89 made us curious to extend our studies to mechanisms of entry and RNA penetration of other ICAM-1 binding RVs in HeLa cells. We thus comparatively investigated the endocytosis pathways of four types of ICAM-1 binding RVs: RV-B3, RV-B14, RV-A16, and RV-A89. Our data reveal that internalization of RV-B14 and RV-A89 occurs via multiple routes. They enter the cells through clathrin-, dynamin- and lipid raft/caveolae-mediated endocytic routes, as well as via macropinocytosis. Applying inhibitors, which have an impact on actin function, we demonstrate that all four serotypes require the actin cytoskeleton and macropinocytosis for internalization. We also analyzed the influence of ciliobrevin, a dynein inhibitor, on infection of all four serotypes. Ciliobrevin inhibits infection of RV-A16 and RV-A89 significantly, suggestive for transfer of RV-A16 and RV-A89 to the endocytic recycling compartments (ERC) for productive uncoating. Collectively, these findings would assist the improvement of antiviral agents targeting uptake and/or intracellular routes of all RVs.

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